朱 謀，王繼文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

羽色作為鴨的一個重要質(zhì)量性狀，可用于區(qū)別鴨品種，鑒定品種純度等。白羽鴨在外表美觀性、屠宰后胴體品質(zhì)等特點(diǎn)上具有一定優(yōu)勢，其羽毛是制作羽絨等輕紡工業(yè)的珍貴原料，而且屠宰后的胴體潔白美觀，故受到顧客的喜愛。鴨的羽毛顏色和羽色分布與其體內(nèi)黑色素的產(chǎn)生、分布、積累有一定關(guān)系，黑色素生成比較少的個體呈白色，黑色素產(chǎn)生越多，其羽毛顏色越接近黑色，由此產(chǎn)生了大量的羽色類型。

研究表明TYR基因編碼的酪氨酸酶（tyrosinase）是一種l型膜結(jié)合糖蛋白，作為黑色素形成通路上的重要成員，是動物體細(xì)胞中黑色素合成的重要功能酶和限速酶[1]。它催化酪氨酸氧化成多巴，再將多巴氧化成多巴酮，從而參與黑色素合成。鄭嫰珠等[2]發(fā)現(xiàn)在TYR基因在半番鴨和番鴨黑羽皮膚中的表達(dá)量分別為白羽皮膚的2.50和14.45倍，而TYR基因的異常表達(dá)往往會產(chǎn)生白色表現(xiàn)型個體[3]。由此可以發(fā)現(xiàn)，TYR基因的表達(dá)水平和黑色素沉積有一定關(guān)系。

TYR是目前研究黑色素合成的重要候選基因，定義為albino/C基因座，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，其外顯子1包含了至少95%的遺傳信息。雞TYR基因被定位在1號染色體的長臂4區(qū)4帶,為復(fù)等位基因[4]。陳志強(qiáng)等[5]對中國烏骨雞TYR基因外顯子1進(jìn)行PCR-SSCP分析，得到其與雞黑色素沉積表型存在相關(guān)性。朱志明等[6]通過PCR擴(kuò)增得到鴨TYR外顯子1中630 bp的片段，發(fā)現(xiàn)其具有高度保守性，并發(fā)現(xiàn)存在一個同義突變位點(diǎn)，但他們卻并沒有將該段序列的SNPs位點(diǎn)多態(tài)性與羽色進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，這正是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵目的之一。本試驗(yàn)個體選自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場，實(shí)驗(yàn)群體櫻桃谷鴨D系和連城白鴨的雜交F1代全為灰羽，F(xiàn)1自交后代出現(xiàn)4種羽色表現(xiàn)型。為了解其羽色性狀差異是否與TYR外顯子1多態(tài)性存在相關(guān)性，進(jìn)行鴨TYR基因外顯子1引物設(shè)計，并測序檢測其SNP位點(diǎn)，對多態(tài)位點(diǎn)與羽色相關(guān)表型的關(guān)系進(jìn)行統(tǒng)計分析。本研究可確定TYR作為羽色調(diào)控基因的地位和調(diào)控位點(diǎn)，可為鴨羽色選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

櫻桃谷鴨D系與連城白鴨雜交得到F1代灰羽個體，F(xiàn)1自群繁育得到F2代群體，且F2代存在4種羽色（白羽、灰羽、麻羽、黑羽），隨機(jī)選取F2代共146只（白羽70只、灰羽34只、麻羽34只、黑羽8只，個體羽色圖片見圖1）進(jìn)行靜脈采血，并拍照記錄選取個體的羽色性狀。本文實(shí)驗(yàn)動物均來自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽育種場。

1.2 血樣采集與DNA提取與檢測

將200 μL檸檬酸鈉抗凝劑裝入1.5 mL EP管中，并且依次標(biāo)號，每個EP管號對應(yīng)一個鴨腳號。鴨腳靜脈采血，并以小于5∶1的比例置于裝有檸檬酸鈉抗凝劑的EP管中，搖勻，置20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用常?guī)苯酚抽提法提取鴨基因組總DNA，溶于TE溶液中。用濃度測定儀測定DNA濃度，稀釋DNA終濃度至50～300ng/μL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 TYR基因外顯子1序列的擴(kuò)增

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)表的鴨（GeneID：101791683）TYR基因的外顯子1序列，使用DNAMAN對其與紅色原雞TYR外顯子1（NM_204160.1）、人類TYR外顯子1（KJ904580.1）序列進(jìn)行同源性比對，尋找到保守序列，用Primer Premier 5.0軟件對該保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計，得到一對能擴(kuò)增出TYR基因外顯子1序列的引物（見表1），引物由華大生物科技有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

實(shí)驗(yàn)使用 PCR buffer、dNTP、Mg2+及 PCR 反應(yīng)穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑的混合工作液2×Taq Master-Mix。加入模板、引物和滅菌超純水后組成30 μL反應(yīng)體系。

PCR擴(kuò)增程序：預(yù)變性95℃，5 min；變性95℃，45 s；退火溫度 57.3℃，30 s；72℃延伸 70 s，36個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物檢測：以1×TBE作為緩沖液，于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，電壓170 V，電泳時間4～10 min，紫外燈下檢測擴(kuò)增結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)照膠，拍照保存。

圖1 各羽色實(shí)驗(yàn)組鴨羽色記錄圖Figure 1 Ducks from different experiment group divided by colour

表1 TYR外顯子1擴(kuò)增引物信息Table 1 The information of the primers for first exon of TYR

1.4 測序及序列對比

將擴(kuò)增效果較好的PCR原液送上海英俊生物科技有限公司進(jìn)行測序，得到的序列信息通過比對反向測序峰圖，校正誤讀位點(diǎn)，測序結(jié)果使用DNAMAN進(jìn)行序列比對分析，找出SNP位點(diǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用PopGen32軟件統(tǒng)計基因頻率、基因型頻率等遺傳參數(shù)，并得到多態(tài)信息含量（PIC）、Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)等遺傳多態(tài)性參數(shù)。利用SPSS軟件對不同羽色群體中基因型頻率差異顯著性進(jìn)行卡方標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)，同時對羽色性狀與T基因頻率、C基因頻率、CC基因型頻率進(jìn)行相關(guān)分析。并利用MEGA5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

以提取得到DNA為模板，以TYR F、TYR R為引物擴(kuò)增TYR基因外顯子1序列。PCR擴(kuò)增效果如圖2所示，每條引物所擴(kuò)增的特異性條帶與所設(shè)計的目的片段大小相同，并且目的條帶清晰，擴(kuò)增效果較好。

圖2 不同實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物電泳膠圖Figure 2 Electrophoresis of PCR product,Different individuals of experiment group

2.2 實(shí)驗(yàn)所得序列比對確認(rèn)

通過NCBI BLAST進(jìn)行物種間同一性比對，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)所得TYR外顯子1與紅色原雞TYR外顯子1（L46805.1）一致性為 99%，與鸕鶿（XM_009480710.1）、丹頂鶴（XM_010298957.1）等TYR基因序列也保持98%以上的一致性,確認(rèn)擴(kuò)增序列為TYR外顯子1，進(jìn)行下一步分析。

2.3 TYR基因結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），分析實(shí)驗(yàn)所得序列的編碼區(qū)，確定其位置并進(jìn)而翻譯成氨基酸序列，得到第一外顯子從第34位堿基到第876位堿基，長度為843個堿基（見圖3），并翻譯得到由281個氨基酸組成的多肽。

圖3 鴨TYR第一外顯子核酸序列（ATG開頭）Figure 3 The nucleotide sequence of the first exon of TYR gene and its predicted amino acid sequence，the sequence lasts 843 bp and starts with ATG

將推導(dǎo)出的氨基酸序列在nblast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行搜索，與綠頭野鴨等多個近緣物種酪氨酸酶蛋白氨基酸序列均100%匹配，驗(yàn)證了該段序列的正確性。

使用DNASTAR Editseq對所得TYR外顯子1片段進(jìn)行堿基組成分析，得到A、G、T、C的堿基數(shù)分別為 195（23.13%）、222(26.33%)、216(25.62%)、224（26.57%）。A+T共441個堿基（49.46%），C+G共446個堿基（51.95%）。A+T含量與G+C含量大致相同，這與其他鳥類相似。

2.4 TYR外顯子1 SNP群體遺傳學(xué)分析

將得到的146個基因序列進(jìn)行校對，再通過DNAMAN進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)存在一個SNP位點(diǎn)（507 T→C），屬無義突變，本突變?yōu)楸敬卧囼?yàn)新發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)，該位點(diǎn)存在3種基因型（TT CT CC，峰圖見圖4），其中在雞中T為優(yōu)勢等位基因，但在該群體中C為優(yōu)勢等位基因。且在黑色羽毛個體中未發(fā)現(xiàn)TT個體。

圖4 507 T→C位點(diǎn)測序峰圖Figure 4 Sequencing the peak figures of different genetype for 507 T→C

使用PopGen32軟件計算得到群體基因純合度（Ho）、雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）。由表 2可知，本群體雜合度較高（PIC＞0.5），并處于高度多態(tài)。

表2 不同基因型群體分析Table 2 The images that indicate different genetypes and group genetype analysis

2.5 TYR外顯子1 SNP與羽色數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)性分析

將這146個個體的羽色數(shù)據(jù)與基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)統(tǒng)計分析，使用PopGen32軟統(tǒng)計基因頻率、基因型頻率、有效等位基因等遺傳多態(tài)性指標(biāo)，并得到多態(tài)信息含量（PIC）（見表 3）、Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（HW P）等遺傳多態(tài)性參數(shù)。各個羽色群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，白色、灰色、黑白色群體處于高度多肽（PIC＞0.5），而黑色群體處于中度多肽（0.5＞PIC＞0.25）。

表3 不同羽色分組相應(yīng)基因型相關(guān)性分析Table 3 The analysis of genetypes for different group categorized by colour

觀察507 T→C位點(diǎn)基因型在各羽色中的分布，可發(fā)現(xiàn)T等位基因可能與鴨白羽有一定關(guān)聯(lián)，在黑色個體中不存在TT個體，且隨個體羽色的加深（白色→黑白色→灰色→黑色），CC個體分布的概率減少，C頻率也在增加，推測其與黑羽性狀有關(guān)聯(lián)。通過SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析（使用單因素方差分析，Bonferroni檢驗(yàn)后進(jìn)行兩兩比較），得到羽色相對值與 T基因頻率（P=0.07）、C 基因頻率（P=0.07）、CC 基因型頻率（P=0.055）的相關(guān)系數(shù)，可知羽色與C基因型頻率存在一致性，但不顯著。

2.6 基于鳥類TYR外顯子1的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中尋找到多個鳥類TYR外顯子1序列，通過MEGA5.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行剪切分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從圖5可以看出鴨在TYR外顯子1的基因進(jìn)化上，與雞、鵪鶉、鴕鳥、孔雀等馴化程度比較高的禽類比較近緣，與雀屬、丹頂鶴、朱鹮等野生禽類比較遠(yuǎn)緣。

圖5 基于鳥類TYR外顯子1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 5 The phylogenetic tree based on data of avian first exon of TYR

3 討論

在人類中，TYR基因上Arg402Gln位點(diǎn)的突變被發(fā)現(xiàn)與眼色和皮膚顏色有一定關(guān)系[7]，而TYR基因SLC24A5位點(diǎn)上的突變可能不同人種體表黑色素含量的差異[8]，楊舒黎等[9]通過對烏骨綿羊TYR基因64位點(diǎn)設(shè)計酶切位點(diǎn)檢測TYR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其外顯子1上存在2個SNPs位點(diǎn)，且該突變與烏骨相關(guān)性狀基因緊密連鎖，檢測結(jié)果顯示TYR基因多態(tài)性與毛色的表型相關(guān)極顯著（P＜0.01）。

關(guān)于禽類TYR基因多肽性與羽色方面的研究已經(jīng)有很多，在雞和鵝中，TYR的SNP位點(diǎn)分布是與羽色性狀存在顯著或極顯著相關(guān)的。張建勤等[10]采用PCR-SSCP方法，對多個國內(nèi)外雞種TYR基因5’非編碼區(qū)與外顯子的13個位點(diǎn)的遺傳變異進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在不同雞種中存在顯著或極顯著差異。Li G.等[11]對40只藏雞進(jìn)行Z染色體的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)3個與皮膚顯著相關(guān)的全新SNP位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)與黑色素沉積基因位置相近。Liu W.B.等[12]在對白色、黃色、灰色、黑色家雞TYR基因發(fā)育表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)該基因表達(dá)量隨著年齡增長而產(chǎn)生顯著差異。Ando H.等[3]在雞TYR基因的第四內(nèi)含子上插入一段完整的禽類白血病的序列，結(jié)果導(dǎo)致雞的隱性白羽的形成。Wang Y.[13]等對鵝TYR外顯子1部分片段進(jìn)行擴(kuò)增測序，比對后發(fā)現(xiàn)3個突變位點(diǎn)（280T→C，345G→A，369G→A），進(jìn)行單倍型分析后發(fā)現(xiàn)，其中4個單倍型與浙東白鵝的白羽性狀顯著相關(guān)。

本試驗(yàn)得到了鴨TYR外顯子1的核酸序列，通過比對僅發(fā)現(xiàn)1個SNP位點(diǎn)，與朱志明等[6]所做的研究相似，說明了該段序列高度保守性，從圖3中也可以看出其保守性。在雞中檢測到TYR基因的外顯子1也是保守序列，并已測出其多肽性位點(diǎn)[14]。在本試驗(yàn)群體遺傳分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)群體整體雜合度較高，可能是因?yàn)镕1代由櫻桃谷鴨D系與連城白鴨雜交形成，未進(jìn)行純繁。由哈溫平衡狀態(tài)分析，可知F2代群體整體處于平衡狀態(tài)，由Ne，PIC等多肽信息參數(shù)可知，該群體遺傳資源豐富，有利于進(jìn)一步篩選提取目的羽色群體。樣本中507 T→C位點(diǎn)基因型為CT的數(shù)量最多，且各個羽色群體均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，白色、灰色、花色群體處于高度多態(tài)，而黑色群體處于中度多肽?；蛐头植荚诟鱾€羽色群體中分布差異不顯著，但羽色相對值與C基因頻率存在相關(guān)性，Gong Y.等[15]研究發(fā)現(xiàn)在連城白鴨為親本的雜交后代中，羽色性狀由2個等位基因（Cc/Tt）決定，其中Cc決定黑色素的生成，Tt決定黑色素的轉(zhuǎn)移，且兩基因座存在加性效應(yīng)與互作效應(yīng)，兩者作用會產(chǎn)生灰色表現(xiàn)型，而黑色表型可能是由T基因座決定的。這可能說明在鴨中TYR并非羽色這個多基因所決定性狀的主效基因，也可以考慮其他羽色基因的加性效應(yīng)與互作效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)也為以后探究鴨羽色性狀與基因多態(tài)性相關(guān)性打下了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

鴨TYR基因外顯子1核苷酸序列長843 bp，編碼281個氨基酸，并與雞TYR外顯子1高度相似，鴨TYR基因外顯子1為高度保守序列。鴨TYR基因外顯子1上存在1個SNP位點(diǎn)（507T-C），屬無義突變。本實(shí)驗(yàn)群體基因型分布在各個羽色群體中分布差異不顯著，然而羽色性狀分布與C基因頻率存在一致性，但不顯著。TYR可能并非控制羽色的主效基因，但它和羽毛性狀存在相關(guān)性。

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