張廣志 王加寧 吳曉青 周方園 張新建 趙曉燕 謝雪迎 周紅姿

（山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院） 山東省科學(xué)院生態(tài)研究所，濟(jì)南 250014）

我國(guó)設(shè)施蔬菜產(chǎn)業(yè)自20世紀(jì)80年代中期以來，得到迅速發(fā)展。截止2015年，我國(guó)設(shè)施蔬菜面積已經(jīng)達(dá)到388.84萬hm2，產(chǎn)值超過蔬菜總產(chǎn)值的60%［1］。由于設(shè)施蔬菜經(jīng)濟(jì)附加值高，長(zhǎng)期處于高集約化、高復(fù)種指數(shù)、高肥料、農(nóng)藥施用量的生產(chǎn)狀態(tài)，導(dǎo)致土壤次生鹽澤化、養(yǎng)分失調(diào)、酸化，土壤肥力下降，微生物生態(tài)失衡，土傳病蟲害及農(nóng)藥殘留等也日益加重［1］。利用微生物或生物制品可降解農(nóng)藥殘留，防控土傳病蟲害，提升土壤肥力，是解決設(shè)施蔬菜可持續(xù)發(fā)展瓶頸的主要手段之一［2］。

木霉（Trichoderma）是土壤微生物的優(yōu)勢(shì)種群，一直作為生防菌或促生菌被廣泛研究和應(yīng)用，近年來的研究表明木霉在土壤和水源污染（如農(nóng)藥等有機(jī)物污染或重金屬污染）修復(fù)方面也有較高的研究應(yīng)用價(jià)值［3］。張廣志等［4，5］從長(zhǎng)期施藥的設(shè)施蔬菜土壤中分離出的多株木霉菌，在生防和農(nóng)殘修復(fù)方面，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。木霉越來越成為一種極具應(yīng)用開發(fā)潛力的微生物資源，可以協(xié)同解決設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中存在的多個(gè)問題，發(fā)揮其功能多樣化的優(yōu)勢(shì)［6］。但是微生物活體菌劑一直存在效果不穩(wěn)定的應(yīng)用瓶頸，通常在盆栽及小區(qū)試驗(yàn)，或者在無菌土壤以及與殺菌劑配合使用時(shí)，才能保證較理想的效果。原因主要在此試驗(yàn)環(huán)境下，菌種較容易保持其種群優(yōu)勢(shì)，有效發(fā)揮群體效應(yīng)。而在設(shè)施田間使用時(shí)，活體菌種除了受到日益惡化的土壤環(huán)境因素影響外，還要受到其他微生物種群以及同類微生物群體的影響。此外，設(shè)施土壤普遍應(yīng)用的消毒方式，也使得土壤原微生物種群多樣性結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，某些適應(yīng)性強(qiáng)的有害微生物占據(jù)了優(yōu)勢(shì)，這些均會(huì)對(duì)施入微生物菌種的適應(yīng)和定殖競(jìng)爭(zhēng)造成威脅。為了更好了解設(shè)施土壤中木霉的多樣性，本研究探索番茄根圍土樣中的木霉種群結(jié)構(gòu)、相對(duì)種群密度及功能活性特征，旨在為研究木霉的生態(tài)學(xué)，深入挖掘木霉菌資源及提高在設(shè)施農(nóng)業(yè)上的高效應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣選擇 樣品采自山東壽光紀(jì)臺(tái)鎮(zhèn)任家洼村一個(gè)連續(xù)20多年種植番茄的日光溫室，五點(diǎn)取樣，植株連根拔起，輕抖，僅帶根圍表面少量土壤，無菌袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 木霉選擇性培養(yǎng)基（THSM）：K2HPO40.90 g；MgSO4·7H2O 0.20 g；NH4NO31.0 g；KCl 0.15 g；葡萄糖 3.0 g；孟加拉紅0.15 g；瓊脂 15.0 g；蒸餾水 1.0 L。滅菌后加入氯霉素 0.25 g，鏈霉素 0.03 g和五氯硝基苯 0.2 g；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 15 g、蒸餾水 1 000 mL；無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MSM）：K2HPO41.50 g，KH2PO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，（NH4）2SO40.50 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，CaCl20.04 g，NaCl 0.5 g，H2O 1 000 mL，pH7.0。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌分離 用無菌刷將根系表面土壤刷下，混合，取土樣10 g，加到裝有100 mL無菌水的三角瓶中，置于搖床 140 r/min 15 min。取1 mL 土壤懸液加入9 mL無菌水的試管中，以此稀釋至104倍。采用混菌的方式，即將各稀釋濃度的菌懸液1 mL，加入9 cm平板上，再倒入適量50-55℃的木霉選擇性培養(yǎng)基（THSM）［7］，混勻，每個(gè)稀釋梯度3次重復(fù)。25℃恒溫培養(yǎng)，24 h 觀察一次，有疑似木霉菌落出現(xiàn)，用接種針挑出轉(zhuǎn)接到PDA平板上。同樣條件培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)形態(tài)特征分組，去同，保存?zhèn)溆谩?/p>

將番茄根系用0.1%的升汞溶液和75%酒精表面消毒后，用解剖刀將根系切片，轉(zhuǎn)接到上述木霉選擇性培養(yǎng)基上，分離根系內(nèi)生木霉菌，操作同上。通過稀釋倍數(shù)和平板出現(xiàn)的菌落數(shù)，估算各個(gè)木霉菌株在土樣中的相對(duì)種群密度和組成比例情況。

相對(duì)種群密度=稀釋倍數(shù)×該稀釋倍數(shù)平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)平均數(shù)。

1.2.2 木霉菌種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和tef1-α序列鑒定分離的木霉種類。采用真菌基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取DNA，以此為模板擴(kuò)增tef1-α（引物 EF1-728F：5'CATCGAGAAGTTCGAGAAGG 3'和TEF1-LLErev ：5'AACTTGCAGGCAATGTGG 3'）［8-9］。PCR采用C1000 Thermalcycler（BIO RAD），反應(yīng)體系 25 μL ：1 μL 各引物（10 μmol/L），12.5 μL 2×Pfu PCR MasterMix（北京艾德萊生物科技有限公司），1 μL模板DNA，9.5 μL dd H2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min；95℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸60 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存［10-11］。PCR產(chǎn)物送上海生工純化并測(cè)序。測(cè)序 結(jié) 果 提 交 TrichoBLAST（WWW.ISTH.info） 和NCBI Nucleotide BLAST進(jìn)行相似性比較分析。采用MEGA7.0軟件構(gòu)建tef1-α序列系統(tǒng)進(jìn)化樹［12］。

1.2.3 木霉對(duì)幾種常見土傳病原菌的抑菌作用測(cè)定 用經(jīng)滅菌的直徑5 mm打孔器在分別活化2 d的木霉和病原菌（Rhizoctonia solani、Pythium ultimum和Fusarium solani）的菌落邊緣打取菌苔，分別移置于直徑9 cm 的PDA平板上（間距6 cm），于25℃條件下對(duì)峙培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。以只接種病原菌的為對(duì)照。待對(duì)照病原菌菌落快長(zhǎng)到木霉接菌點(diǎn)或木霉菌落快長(zhǎng)到病原菌接菌點(diǎn)時(shí)，測(cè)量各自菌落的半徑，并計(jì)算抑制率［4］。

1.2.4 木霉對(duì)毒死蜱的降解活性測(cè)定 按100 mg/L的濃度將毒死蜱加入到滅菌后的裝有50 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（MSM）的250 mL三角瓶中，分別接種各木霉菌株的孢子懸液（1.0×108cfu/mL）1 mL，以不接木霉孢子懸液的處理為對(duì)照。每處理重復(fù)3次，置于30℃ 140 r/min培養(yǎng)5 d，并利用GC-ECD法檢測(cè)毒死蜱殘留量［13-14］，并計(jì)算降解率。

2 結(jié)果

2.1 毒死蜱降解木霉的分離和鑒定

圖1 木霉菌株的菌落形態(tài)

在木霉選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，陸續(xù)將4個(gè)稀釋梯度，共計(jì)12個(gè)平板上的疑似木霉菌落全部轉(zhuǎn)接到PDA平板上，再繼續(xù)培養(yǎng)3-5 d，通過菌落特征確認(rèn)木霉菌菌株，共獲得木霉菌株126個(gè)，通過菌落形態(tài)結(jié)合鏡檢顯微特征，進(jìn)一步分組，共獲得24個(gè)不同的組，組間菌株形態(tài)差異不明顯，初步確認(rèn)為同一菌株，并各挑一個(gè)代表菌株，依次編號(hào)T1-1-T1-24，重新轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)菌株3次重復(fù)，培養(yǎng)3-5 d，根據(jù)形態(tài)學(xué)和顯微特征的細(xì)微差別進(jìn)一步確認(rèn)分組。從根系中分離內(nèi)生木霉菌16株，同上，最終確認(rèn)不同菌株3株，編號(hào)分別為TN1-1-TN1-3。分離所有27株木霉，PDA平板形態(tài)如圖1所示，產(chǎn)孢簇常呈鮮綠色到暗綠色，分布不均勻，常形成同心圓結(jié)構(gòu)。

將27個(gè)木霉菌株tef1-α序列，提交至TrichoBLAST（WWW.ISTH.info） 和 NCBI BLAST進(jìn)行相似性檢索，結(jié)果表明，土樣中24個(gè)菌株，其中有11個(gè)菌株與T. virens代表菌株GJS 01-287相似度在99%，鑒定為T. virens（綠色木霉）；6個(gè)菌株與T. simmonsii代表菌株S86相似度在99%，鑒定為T. simmonsii（西蒙斯木霉）；3個(gè)菌株與T. atroviride代表菌株DAOM 222144相似度在99%，鑒定為T.atroviride（深綠木霉）；2個(gè)菌株與T. crassum代表菌株DAOM 164916相似度在99%，鑒定為T. crassum（厚木霉）；1個(gè)菌株與T. atrobrunneum代表菌株S369相似度在99%，鑒定為T. atrobrunneum（深褐木霉）。另有1株木霉，經(jīng)過對(duì)比，與所有登記的木霉tef1-α序列相似度均在95 %以下。根據(jù)Bissett［15］公布的木霉種類名錄以及近兩年發(fā)表的新種［16-19］，目前所有被認(rèn)可的木霉種類，均有相應(yīng)的tef1和rpb2序列作為代表序列。tef1和rpb2序列是目前木霉系統(tǒng)發(fā)育分析及種類鑒定的主要依據(jù)，tef1通常比rpb2具有更高的分辨率，除個(gè)別種類外，依據(jù)tef1序列可以對(duì)木霉實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的種類認(rèn)定［15，20］。因此根據(jù)tef1序列與GenBank所有登記的木霉tef1序列的對(duì)比結(jié)果，初步鑒定菌株T1-24為一木霉新種（T.sp.nov.）。3株內(nèi)生木霉菌株TN1-1、TN1-2和TN1-3分別鑒定為T. atroviride、T. simmonsii和T. atrobrunneum，平板菌落形態(tài)與土樣中的同種菌株具有明顯差異，菌落顏色也普遍淺于土樣中菌株。

2.2 木霉菌株的相對(duì)種群密度

土樣中木霉，通過稀釋倍數(shù)和平板出現(xiàn)的菌落數(shù)，估算各個(gè)木霉菌株在土樣中的相對(duì)種群密度。該設(shè)施番茄的根圍土樣中，木霉的總的種群密度大約在104 CFU/g。各個(gè)菌株的組成，如圖2所示，T1-8、T1-23和T1-24三個(gè)菌株是其中優(yōu)勢(shì)菌株，占比分別為30%、20%和20%；其它菌株占比均在5 %或5 %以下。個(gè)別菌株，如T1-2、T1-7、T1-12、T1-16和T1-20，僅能在稀釋10倍的平板上出現(xiàn)，相對(duì)種群密度分別為10 CFU/g、20 CFU/g、30 CFU/g、10 CFU/g、20 CFU/g。

圖2 土壤中木霉各菌株的相對(duì)種群密度組成

2.3 木霉的系統(tǒng)發(fā)育分析

木霉菌株的tef1-α序列極大似然（ML）發(fā)育樹如圖3所示，已知木霉種類的菌株都在臨近的一條發(fā)育分支上，只有一個(gè)疑似新種與其他26株木霉的tef1-α序列相似性僅為92%，且位于相對(duì)較遠(yuǎn)的發(fā)育分支上。由于本發(fā)育樹基于相對(duì)保守序列tef1進(jìn)行構(gòu)建，無法真實(shí)反映木霉種類下的各個(gè)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化情況，導(dǎo)致其中部分菌株，如T. virens的T1-21、T1-23、T1-18、T1-7和T1-11，在同一個(gè)發(fā)育位點(diǎn)上，序列相似性達(dá)到100%，但形態(tài)特征上，尤其菌落特征，如產(chǎn)孢簇分布、密度、顏色、形成同心圓個(gè)數(shù)及大小等方面，具有明顯的差異，仍可確認(rèn)為不同菌株。T1-24菌株與所有登記的木霉tef1-α序列相似度在95%以下，與其他幾個(gè)種的菌株相距較遠(yuǎn)，形態(tài)特征更是未見相似報(bào)道，現(xiàn)確定為一疑似木霉新種，為土壤木霉種類的優(yōu)勢(shì)種群（20.04%），僅次于T. virens（37.37%）和T. crassum（32.06%）；此外該木霉在多個(gè)設(shè)施菜地土樣中常有發(fā)現(xiàn)，應(yīng)該為設(shè)施菜地土壤中的常見木霉種類。

圖3 基于菌株tef1-α序列構(gòu)建的最大似然進(jìn)化樹

2.4 木霉生防活性測(cè)定結(jié)果

平板對(duì)峙條件下，所有27個(gè)木霉菌株對(duì)3個(gè)供試病原真菌均有一定的抑菌作用，且同種不同菌株的抑菌效果有明顯的差異，表明這些同種不同菌株存在進(jìn)化上（功能活性）的差異。其中木霉對(duì)立枯絲核菌（R. solani）的抑菌效果最為顯著（圖4），有13個(gè)菌株的抑菌率超過50%；而西蒙斯木霉（T.simmonsii）的7個(gè)菌株中有6個(gè)菌株的抑菌率超過82.0%，T1-2的抑菌率也達(dá)60.4%，表現(xiàn)普遍的生防潛能；綠色木霉（T. virens）、厚木霉（T. crassum）和深綠木霉（T. atroviride）中也各有1個(gè)菌株對(duì)立枯絲核菌有較高的生防潛能，抑菌率超過80%。

所試木霉菌株對(duì)病原真菌F. oxysporum的抑菌率相對(duì)較低（圖5），僅有7個(gè)菌株的抑菌率超過50%。其中綠色木霉的T1-22、T1-13菌株和厚木霉的T1-8菌株，抑菌率分別為54.1%、55.7%和54.0%；深綠木霉3個(gè)菌株抑菌率分別達(dá)78.7%、77.1%和63.9%，菌株T1-9卻僅為27.9%；新種T1-24抑菌率也達(dá)67.2%。對(duì)病原菌V. dahliae的抑菌率普遍較差（圖6），除西蒙斯木霉T1-15菌株抑菌率51.6%外，其它菌株抑菌率均在50%或50%以下；其中西蒙斯木霉的幾個(gè)菌株，相對(duì)較好，抑菌率集中在45.3%-51.6%。

2.5 木霉對(duì)毒死蜱降解效果

圖4 木霉菌株對(duì)立枯絲核菌的抑菌效果

圖5 木霉菌株對(duì)尖孢鐮孢菌的抑菌效果

圖6 木霉菌株對(duì)大麗輪枝菌的抑菌效果

圖7 木霉菌株對(duì)毒死蜱的降解效果

降解試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，除深褐木霉（T.atrobrunneum）兩個(gè)菌株對(duì)毒死蜱的降解效果不明顯外；其它種類的木霉，均有菌株能有效降解毒死蜱，如綠色木霉T1-10、西蒙斯木霉的T1-2、深綠木霉的TN1-1、厚木霉的T1-6和疑似新種的T1-24菌株對(duì)毒死蜱的降解率分別最高達(dá)到58.3%、82.5%、72.1%、63.0%和38.2%。也有一些菌株，如綠色木霉T1-21、西蒙斯木霉T1-12等5個(gè)菌株孢子在含有100 mg/L毒死蜱的無機(jī)鹽溶液中不能萌發(fā)或生長(zhǎng)，也未見有降解效果。降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，同一個(gè)種的不同木霉菌株，對(duì)毒死蜱的降解效果也存在顯著差異，表明木霉菌的系統(tǒng)進(jìn)化過程，不僅表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)特征上，在功能活性上也有體現(xiàn)。

3 討論

通過對(duì)設(shè)施番茄根圍土樣和根圍內(nèi)生木霉進(jìn)行分離，依照形態(tài)學(xué)特征上的差異，共獲得27個(gè)不同木霉菌株（3株屬于內(nèi)生木霉菌），這些木霉菌株產(chǎn)孢簇呈鮮綠色到暗綠色，產(chǎn)孢簇分布不均勻，常圍繞接菌點(diǎn)形成同心圓結(jié)構(gòu)。同種類的木霉不同的菌株，形態(tài)學(xué)特征相似，但仍存在細(xì)微差別可以加以區(qū)分。結(jié)合tef1-α序列分析，鑒定27個(gè)菌株分別屬于5個(gè)已知木霉種和1個(gè)疑似新種。所有菌株對(duì)R.solani、F. oxysporum和V. dahliae三種具有代表性的土傳病原真菌具有普遍的不同程度的拮抗作用，同時(shí)，除厚木霉外，其它種類的木霉均有少數(shù)個(gè)別菌株能有效降解毒死蜱，表現(xiàn)土壤農(nóng)殘修復(fù)的潛力。因此利用木霉菌，更容易篩選到兼具兩種功能甚至多種功能的木霉菌資源，實(shí)現(xiàn)生物防治與土壤農(nóng)化殘留降解的協(xié)同應(yīng)用目標(biāo)，對(duì)于設(shè)施農(nóng)業(yè)減少殺菌劑使用，延緩抗藥性；降解農(nóng)藥殘留，減少農(nóng)殘危害具有重要的意義。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，一定程度上反映了各個(gè)種類及菌株的進(jìn)化發(fā)育關(guān)系，但由于tef1-α作為種類鑒定的序列標(biāo)記，并不能反映菌株實(shí)際進(jìn)化上的差異，因此，同種下的木霉部分菌株tef1-α序列相似性達(dá)到100%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一進(jìn)化分支。土壤中的木霉通常由幾種不同種類組成，每個(gè)種類的木霉可能存在不同的進(jìn)化菌株，本研究中各菌株形態(tài)特征的細(xì)微差異及功能活性的不同差異給予其有效地證明。

不同的木霉菌株在土壤中的的種群密度也存在巨大差異，如T1-12相對(duì)種群密度僅為30 CFU/g，而T1-8相對(duì)種群密度約為T1-12的100倍，因此對(duì)土樣的木霉菌株最大程度的分離是研究土壤木霉資源及生態(tài)多樣性的基礎(chǔ)。本研究通過專用的木霉選擇性分離培養(yǎng)基，設(shè)置不同的土壤稀釋梯度，并通過混菌的方式，最大程度地對(duì)土樣中的木霉菌株進(jìn)行了分離，尤其對(duì)種群密度相對(duì)極低的5個(gè)木霉菌株（10-30 CFU/g）也能有效進(jìn)行分離，效率顯著。本研究表明，設(shè)施菜地土壤中，木霉具有豐富的多樣性，功能活性上的差異，也驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)特征上的菌株差異在不同菌株確認(rèn)上應(yīng)用的可行性，該特征可指導(dǎo)土壤中功能木霉的挖掘和篩選工作。該根圍土樣中木霉總的種群密度總體不高，約在104CFU/g，優(yōu)勢(shì)種為T. virens、T. crassum和T.sp. nov.，且只是個(gè)別菌株（T. virensT1-23、T. crassumT1-8和T.sp. nov. T1-24）占優(yōu)勢(shì)，表明這3個(gè)菌株在設(shè)施番茄根圍土樣中具有更好的適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)能力。但在對(duì)3種病原真菌的抑菌試驗(yàn)以及對(duì)毒死蜱的降解試驗(yàn)中，表現(xiàn)卻并不理想。因此在功能活性菌株的篩選過程中，很容易被舍去，而是選擇抑菌活性高或降解毒死蜱效率的菌株，如菌株T1-14、T1-4、T1-15以及T1-2，但這些菌株在土壤中的相對(duì)種群密度卻很低，即1.0×102CFU/g、1.0×102CFU/g、2.0×102CFU/g或10 CFU/g，預(yù)示在設(shè)施農(nóng)業(yè)土壤中可能適應(yīng)性或定殖競(jìng)爭(zhēng)能力差，外源加入該環(huán)境的土壤中，種群優(yōu)勢(shì)很難得到持久保障，難以更長(zhǎng)時(shí)間地發(fā)揮作用。由此表明，在農(nóng)業(yè)微生物菌株的篩選過程中，除了考慮功能活性的高低外，也要考慮其種群密度或在環(huán)境中的適應(yīng)性，才能篩選獲得更具實(shí)際應(yīng)用潛力的菌株資源；或者通過其它措施提高試驗(yàn)期內(nèi)的種群密度優(yōu)勢(shì)，從而保證發(fā)揮其群體效應(yīng)。

4 結(jié)論

從連續(xù)多年栽培番茄的設(shè)施大棚根圍土樣中分離木霉菌，研究其種群多樣性和相對(duì)種群密度，同時(shí)測(cè)定對(duì)植物病原真菌的抑菌活性和對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解活性。共獲得6個(gè)不同的木霉種類，27個(gè)不同的木霉菌株。各木霉菌株在土樣中種群密度差異很大。所有木霉菌株對(duì)幾種常見土傳病原真菌具有普遍的不同程度的抑菌活性，部分菌株能有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥毒死蜱，可以實(shí)現(xiàn)生物防治與土壤農(nóng)化殘留降解的協(xié)同應(yīng)用目標(biāo)。

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