杜 維， 阮成江*， 丁 健， 李景濱， 李 賀， 王 莉

(生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室,大連民族大學資源植物研究所,遼寧大連 116600)

油茶(Camelliaoleifera)是我國南方重要的油料樹種，也是世界四大木本油料之一[1]。油茶花果同期，內(nèi)源激素如生長素(IAA)、赤霉素(GA)、玉米素(tZ)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等會影響果實發(fā)育及花芽形成與分化[2 - 4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，同一結(jié)果枝上不同部位激素既相互制約又相互影響，例如油茶果實發(fā)育過程中內(nèi)源GA、IAA和ABA濃度較高[5]，但枝條內(nèi)高濃度GA可能不利于花芽分化與成花[6]。因此同一枝條上不同部位5種內(nèi)源激素的同時測定有助于探索激素間協(xié)同及拮抗作用機理[7 - 8]，為闡明內(nèi)源激素對油茶果實及花芽分化影響以及使用激素誘導油茶花芽分化等研究提供理論依據(jù)。

內(nèi)源植物激素在植物中含量很低，雜質(zhì)成分多且復雜，難以做到對小范圍組織激素的精確測定。目前，對油茶內(nèi)源激素的測定主要采用酶聯(lián)免疫法[9]和液相色譜法[10 - 11]，還未見使用液-質(zhì)聯(lián)用法的相關報道。液-質(zhì)聯(lián)用法具有檢測器選擇性強，靈敏度高等優(yōu)勢[12]，但該方法在進樣前需要采用固相萃取(SPE)技術(shù)去除雜質(zhì)，以避免質(zhì)譜污染和減弱雜質(zhì)帶來的基質(zhì)效應[13 - 17]。由于不同激素間的理化性質(zhì)不同，不同種類的固相萃取柱往往只能針對2～3種結(jié)構(gòu)相似的激素進行純化，同時純化多種激素無法保證較高回收率。本研究充分挖掘混合型陽離子交換SPE柱(MCX)的分離特點，優(yōu)化提取條件達到只使用單一MCX柱同時對油茶不同組織(枝條、嫩葉、花芽和果實)的IAA、GA4、tZ、ABA和JA 5類激素進行分離純化，然后利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)進行測定，為植物中5種內(nèi)源激素的精確定量提供科學可靠的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

API 3200三重四極桿質(zhì)譜儀(美國，AB公司)；DGU-20A液相色譜系統(tǒng)(日本，島津公司)；MCX固相萃取柱(3 cc/60mg，30 μm，美國Waters公司)。

吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid，IAA)標準品(阿拉丁)、脫落酸(Abscisic Acid，ABA)、茉莉酸(Jasmonic Acid，JA)、玉米素(Trans-zeatin，tZ)、赤霉素(Gibberellin A4，GA4)標準品(美國Sigma公司)；甲醇、甲酸(色譜純，Honeywell)；乙酸銨(優(yōu)級純，科密歐)。標準溶液配制：分別精確稱取2 mg各標準品，溶于5 mL甲醇中，配制成400 μg/mL單標儲備液，取5 μL儲備液稀釋到2 mL為1 μg/mL，用于優(yōu)化質(zhì)譜條件。各取250 μL單標儲備液用甲醇定容到100 mL，配制成1 μg/mL的標準混合液用于標準曲線的測定，標準混合液濃度梯度為0.5、1.5、10、50、100、500、1 000 ng/mL。

油茶不同組織(二年生枝條、嫩葉、花芽、種仁)樣本于2016年9月7日采自貴州玉屏侗族自治縣。取樣后經(jīng)液氮冷凍，于-80 ℃保存。

1.2 實驗條件

1.2.1液相色譜-質(zhì)譜條件色譜條件：采用島津C18色譜柱(150×4.6 mm，5 μm)；ESI(+)模式下流動相A為0.1%甲酸，流動相B為甲醇；ESI(-)模式下流動相A為水溶液，流動相B為甲醇。質(zhì)譜條件：為使目標物盡可能離子化，提高儀器測定靈敏度，采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)檢測IAA、tZ；負離子模式(ESI-)檢測ABA、GA4、JA。離子化電壓(+5 500/-4 500 V)；TEM 550 ℃；氣簾氣壓力30 psi；掃描方式為多反應監(jiān)測(MRM)模式。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件和液相條件如表1、2所示，質(zhì)譜圖如圖1所示(濃度30 ng/mL)。

表1 MRM模式下質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for tandem mass spectrometry

表2 激素測定的高效液相色譜條件Table 2 Conditions of HPLC for measurement of hormones

*:mobile phase A was water,B was methanol.

圖1 5種被測激素的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of five hormone

1.2.2樣品處理與條件優(yōu)化取油茶不同組織樣本1～2 g，置于研缽中，加入液氮快速研磨，將磨碎的粉末稱重后(差量稱重)移入離心管中，加入5 mL提取溶劑(含75%甲醇、5%甲酸水溶液)，于4 ℃過夜提取。次日10 000 r/min 離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移到新管，沉淀用2 mL提取液清洗兩次，合并提取液后用氮氣吹干甲醇。

固相萃取前需要將氮吹濃縮后的樣品復溶，溶劑極性較弱會影響非極性樣品與固相萃取柱的結(jié)合效率，導致樣品回收率降低；溶劑極性過強可能會使非極性樣品復溶效率降低。為了保證固相萃取最佳的提取效率和回收率，對固相萃取前激素復溶的溶劑極性進行優(yōu)化。用含有不同濃度甲醇的1 mol/L甲酸水溶液復溶，定容至10 mL，進行固相萃取。

1.2.3固相萃取與條件優(yōu)化固相萃取柱按填料種類劃分可分為正相材料、反相材料、無保留載體材料。除無保留載體材料外，正反相材料的保留機理大多包含極性/非極性相互作用、離子交換作用。本文采用混合陽離子反向交換柱(MCX)作為固相萃取柱，MCX同時具有強陽離子交換作用、非極性相互作用以及弱極性相互作用。分別用2 mL甲醇、2 mL 1%甲酸水溶液活化，之后加入樣品溶液過柱，甲醇洗脫得到IAA、GA4、ABA、JA；用含有0.35 mol/L氨水的60%甲醇水溶液洗脫得到tZ，在保證回收率前提下以1、1.5、2、3 mL梯度對激素洗脫體積進行優(yōu)化。混合兩次洗脫液氮氣吹干后用甲醇定容，過0.22 μm濾膜后，待上樣測定。

1.2.4方法學考察稀釋標準品混合液，配制成6個濃度梯度混合標準品溶液(1、5、20、50、100、200、500 ng/mL)，測定后繪制標準曲線。取不同數(shù)量級的2個濃度(1 ng/mL和100 ng/mL)標準混合液，待樣品粉碎后加入，考察方法的精密度以及標準品在葉片樣品中加標回收率，每組實驗做三組平行。以三倍信噪比(S/N=3)計算檢出限。

2 結(jié)果與討論

2.1 激素提取原理

由于植物樣品中含有大量天然吡咯衍生物類、多烯類、酚類和酮類色素，如不去除會對色譜柱和離子源造成污染。本文用非極性溶劑提取，極性溶劑復溶的方法可以除掉大部分的吡咯衍生物類、多烯類以及酮類色素，后經(jīng)固相萃取可以去除一部分的酚類色素。內(nèi)源激素IAA、ABA、GA4、JA和tZ的logP值(親水系數(shù))分別為2.26、2.24、2.13、2.02和0.776，疏水性較強的前4種激素(酸性激素)在強酸性條件下不電離，可用非極性相互作用在MCX萃取柱中保留，用甲醇即可洗脫。極性較強的堿性激素tZ在酸性條件下帶正電荷被MCX以更強的陽離子交換作用所保留，可用0.35 mol/L 60%的氨化甲醇洗脫，這樣可做到只使用MCX一種固相萃取柱即可對這5種激素進行保留和洗脫。

2.2 固相萃取前溶劑極性優(yōu)化

對固相萃取前溶劑極性優(yōu)化(圖2)，以強陽離子交換作用得到保留的tZ回收率一直保持在95%以上，除tZ外溶劑極性對其他激素回收率的影響較大。隨著溶液極性的下降可以增加非極性激素的溶解性，但會顯著降低固相萃取柱對非極性相互作用四種激素(IAA、GA4、ABA和JA)的保留。在不含甲醇的溶劑下該四種激素提取率達到最高的97%、99%、95%和89%。故選用1 mol/L甲酸溶液(不含甲醇)復溶提取物可以保證目標激素有較高的回收。

2.3 固相萃取洗脫體積的優(yōu)化

保證回收率前提下對激素洗脫體積進行優(yōu)化(圖3)，由于tZ為酸性上樣/堿性洗脫，洗脫體積對回收率影響較大，3 mL的洗脫體積才能保證將95%以上的樣品洗脫下來，其余激素2 mL的洗脫液能保證有較高的回收率。洗脫條件確定為：2 mL甲醇洗脫得到IAA、GA4、ABA、JA，3 mL含0.35 mol/L氨水的60%甲醇水溶液洗脫得到tZ。

2.4 標準曲線、檢出限與定量限

在實際樣品中加入標準品繪制標準曲線，可以去除基質(zhì)效應對實驗準確性的影響。由于很難找到不含激素的植物樣品，在實際樣品中加入標準品會使標準曲線的低濃度范圍無法考察，使整個實驗的線性范圍偏高，故本實驗采用標準品考察線性方程，采用加標回收率考察基質(zhì)效應。IAA、ABA、GA4、tZ和JA 5種激素標準曲線的線性相關系數(shù)R2均大于0.995(表3)，呈高度線性；按3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限，換算濃度后得出檢出限依次為0.7、1.2、0.8、0.4、0.5 ng/g，根據(jù)植物的一般激素水平(0.1～100 ng/g)，每次樣品量只需要0.5 g，有利于對植物細小位置內(nèi)源激素的精確測定。

圖2 溶劑極性對激素回收率影響Fig.2 The solvent polarity effect on hormone recovery

圖3 洗脫體積對激素回收率影響Fig.3 The solvent volume effect on hormone recovery

表3 線性方程、檢出限與定量限Table 3 Linear equation,limit of detaction (LOD) and quantification of detection (QOD)

2.5 方法精密度、回收率與基質(zhì)效應

實驗結(jié)果表明，5種激素測定的日內(nèi)精密度(RSD)在5.2%以下(表4)，日間RSD在8%以下，回收率大于80%，標準偏差(SD)在10%以內(nèi)，方法穩(wěn)定，誤差較小。

基質(zhì)效應在液-質(zhì)聯(lián)用主要體現(xiàn)在樣品中的雜質(zhì)會影響被測物的離子化程度，內(nèi)源性的組分如磷脂等會對ESI離子源中被測物電離產(chǎn)生比較強的抑制作用。評價基質(zhì)效應的強弱一般用不含被測物成分的樣品加入被測物標準品進行測定，與預期結(jié)果相比觀察測定數(shù)據(jù)的變化。由于很難找到不含激素的植物樣品，本實驗向提取液中加入已知濃度標準品來確定基質(zhì)效應的強弱。實驗結(jié)果表明，5種內(nèi)源激素加標回收率在79%～101%間，<25%的基質(zhì)效應顯著值，基質(zhì)效應不明顯，在實測樣品時可根據(jù)加標回收率對實測值進行相應補償。

表4 精密度、回收率與基質(zhì)效應Table 4 Relative standard deviation (RSD),recovery and standard addition recovery

2.6 方法應用

用本實驗建立的方法同時測定油茶不同組織中的5種內(nèi)源激素，結(jié)果表明：(1)生長素在花芽中含量最高為1821.6 ng/g，其次為嫩葉218.5 ng/g，但在種仁中較低，僅為57.3 ng/g，且在枝條中未被檢出。9月7日為油茶果實生長發(fā)育的末期，其種仁生長素含量低，花芽處于旺盛期(10月為花期)，生長素含量較高；在花果同期的時間段，油茶枝條生長停止，主要養(yǎng)分用于花芽生長、維持嫩葉生長和種仁油脂積累，這與生長素在不同組織的分布規(guī)律相同。(2)赤霉素A4在嫩葉、種仁官內(nèi)含量較高分別為227.6、52 ng/g，但在花芽中赤霉素A4含量較低(16.5 ng/g)，在枝條中未被檢出。赤霉素在嫩葉種仁等細胞分裂旺盛組織內(nèi)含量較高，與其具有促進植物生長和開花等作用的結(jié)論相一致。(3)玉米素是細胞分裂素的一種，在油茶組織內(nèi)與其他激素相比含量最低，在嫩葉、種仁和枝條中含量較花芽高，分別為3.6、2.3、2.3 ng/g，花芽中玉米素含量最低為1.5 ng/g，分布規(guī)律不明顯。(4)脫落酸在花芽和枝條中含量較高，分別為445.2、456.6 ng/g，是生長旺盛的組織(嫩葉和種仁)含量的3～4倍。油茶花芽從形成至開花需要5～6個月，生長較慢可能與花芽內(nèi)高含量ABA有關。(5)茉莉酸在嫩葉、花芽和枝條中含量接近，在種仁內(nèi)達到最高的978.3 ng/g，是其他組織的2倍以上。種仁作為油茶油脂積累組織，組織內(nèi)含有豐富亞油酸和亞麻酸是JA的合成原料，合成的JA同時又會促進種仁的發(fā)育，這可能是種仁高JA含量的原因。(6)GA與ABA是互為拮抗作用的兩種激素，GA/ABA比值的高低體現(xiàn)出植物組織的生長速度的快慢。測定結(jié)果中GA4/ABA比值由高到低依次為嫩葉、種仁、花芽以及枝條，與油茶該部位的實際分生速度相符。

表5 油茶不同組織中激素測定結(jié)果Table 5 Determination results of hormones in different organs of oil-tea

ND:not detected.

3 結(jié)論

本文建立了只用單一MCX固相萃取柱，結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)同時分析油茶枝條、嫩葉、花芽和種仁中IAA、GA4、tZ、ABA和JA 5種內(nèi)源激素的定量方法。優(yōu)化了固相萃取條件，解決了多種激素同時測定回收率較低的問題。測定結(jié)果顯示油茶的花芽和嫩葉的生長素水平較枝條和果實高，種子中茉莉酸含量最高(978.3 ng/g)，GA4/ABA比例為嫩葉>種仁>花芽>枝條，與油茶各部位生長速度一致。該方法簡便快速，與已發(fā)表酶聯(lián)免疫法和液相色譜法內(nèi)源激素測定文獻相比需要的樣品量少(100～500 mg)、精密度高(RSD<7%)，可以作為一種高通量快速測定植物內(nèi)源激素的方法。

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