一種簡(jiǎn)單的gRNA體外篩選方法

成大欣, 徐麗然, 于清清, 高守翠, 王曉靖, 劉 懿, 劉恩岐, 趙四海

(1. 陜西省人民醫(yī)院新生兒科, 西安 710068; 2. 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心, 西安 710061)

規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)及其相關(guān)蛋白9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR associated protein 9, CRISPR/Cas9)基因編輯技術(shù)是目前最熱門的基因編輯技術(shù)，科學(xué)家們可利用引導(dǎo)核糖核酸(guide ribonucleic acid,gRNA)引導(dǎo)Cas9核酸酶在多種細(xì)胞的特定基因組位點(diǎn)上進(jìn)行切割、修飾[1-3]。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái), 胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES細(xì)胞)只有在小鼠中比較成功地進(jìn)行了體外培養(yǎng)建系, 在其他動(dòng)物, 比如家兔等, 雖然取得一定進(jìn)展, 但離實(shí)際應(yīng)用仍有距離[4]。在基于ES細(xì)胞的基因敲除技術(shù)應(yīng)用上, 由于除小鼠外的動(dòng)物缺乏ES細(xì)胞, 故難在實(shí)現(xiàn)在體的基因敲除[4-6]。由于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效性(成功率可達(dá)90%以上), 可以直接在胚胎上進(jìn)行操作, 不用借助ES細(xì)胞, 這就突破了基于ES細(xì)胞同源重組技術(shù)的種屬限制[1,7-9]。CRISPR/Cas9技術(shù)使得在不同物種進(jìn)行基因編輯成為可能，基因修飾技術(shù)實(shí)施起來(lái)變得更便利，基因修飾動(dòng)物的應(yīng)用得到進(jìn)一步擴(kuò)大[1-3]。除小鼠外的基因修飾動(dòng)物模型, 如家兔[7-11]、大鼠[12,13]、豬[14]和靈長(zhǎng)類[15]基因修飾動(dòng)物模型, 也快速發(fā)展起來(lái)。CRISPR/Cas9技術(shù)的實(shí)施需要研究者自行設(shè)計(jì)gRNA, 引導(dǎo)Cas9核酸酶進(jìn)行切割。如何篩選gRNA,在體外驗(yàn)證其結(jié)合靶序列引導(dǎo)Cas9核酸酶進(jìn)行切割的能力, 往往在實(shí)驗(yàn)前(如受精卵注射)需要進(jìn)行篩選?，F(xiàn)有利用體外培養(yǎng)細(xì)胞驗(yàn)證gRNA效率的方法相對(duì)較復(fù)雜, 花費(fèi)較大。本實(shí)驗(yàn)以家兔扭轉(zhuǎn)蛋白2A(torsin family 2 member A,TOR2A)基因的gRNA設(shè)計(jì)和篩選為例, 介紹一種簡(jiǎn)單的gRNA體外篩選方法(圖1)。相比傳統(tǒng)的gRNA制備方法, 該方法簡(jiǎn)單易行, 不用將打靶序列克隆進(jìn)質(zhì)粒[16]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

圖 1 gRNA打靶效率的篩選Figure 1 In vitro target efficiency screening of gRNAs

pX330 (編號(hào)71707) 質(zhì)粒由密歇根大學(xué)張繼峰博士惠贈(zèng); 瓊脂糖(西班牙Biowest公司); Tris和EDTA(美國(guó)Genview公司); 基因組DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒(美國(guó)Omega Bio-Tek公司); T7-ScribeTMStandard RNA IVT Kit(美國(guó) CELLSCRIPT公司); miRNeasy Mini Kit(美國(guó)QIAGEN公司); Cas9內(nèi)切酶(美國(guó)NEB公司); PCR mix(中國(guó)擎科新業(yè)生物公司); PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司); 電泳儀(中國(guó)北京六一生物科技有限公司); NanoDrop超微量紫外-可見光分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司); 凝膠成像系統(tǒng)(中國(guó)上海培清科技有限公司); 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 gRNA的在線設(shè)計(jì)

以家兔TOR2A(TOR2A ENSOCUG00000006907)為例，根據(jù)分析，將2號(hào)外顯子序列用在線軟件設(shè)計(jì)打靶用gRNA，可選用如http://crispr.mit.edu/或http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx等在線工具。

1.3 gRNA的擴(kuò)增與純化

以pX330質(zhì)粒為模板，正向引物為(用以上選定gRNA序列替換引物中N): TGTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-gttttagagctagaaatagc; 反向引物: AGCACCGACTCGGTGCCACT。PCR程序?yàn)? 98 ℃預(yù)變性 2 min, 94℃變性10 s, 68 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，切割目的片段的凝膠，按膠回收試劑盒說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物。分別以回收產(chǎn)物為模板，按照T7-ScribeTMStandard RNA IVT Kit說(shuō)明書, 選用20 μL體系, 將3個(gè)含gRNA序列的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用miRNeasy Mini Kit純化gRNA,純化后的gRNA用NanoDrop定量，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 含打靶序列的PCR擴(kuò)增與膠回收

抽取普通級(jí)家兔(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK(陜)2012-003)血液200 μL，按基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取基因組DNA用做模板。一般PCR目的片段可設(shè)計(jì)在300～1 000 bp。在TOR2A目的基因擴(kuò)增中, 正向引物: GCCGTCTGGAAGGCTCT; 反向引物: GGAGTGACTGTCACCAGCC，產(chǎn)物為386 bp。98 ℃預(yù)變性 2 min，94 ℃變性 10 s，67 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，切割目的片段凝膠，按膠回收試劑盒說(shuō)明書回收PCR產(chǎn)物。

1.5 體外gRNA引導(dǎo)的Cas9酶切效率鑒定

2 結(jié)果

2.1 gRNA的設(shè)計(jì)、擴(kuò)增與與純化

根據(jù)評(píng)分和脫靶評(píng)估情況，最終選了3個(gè)gRNA打靶序列。分別為gRNA1: GGACCTTAAGAGCTGGGTCC; gRNA2: GCTTGTCCATCTCGTCGAAG; gRNA3: TCTCTTCCTCTTCGACGAGA。用以上序列替換正向引物中的N(TGTAATACGACTCACTATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-gttttagagctagaaatagc)gRNA的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)錄均按試劑盒數(shù)說(shuō)明進(jìn)行，純化回收良好。

2.2 gRNA的引導(dǎo)酶切效率的鑒定

結(jié)果顯示, gRNA2和gRNA3引導(dǎo)的Cas9酶切效率比較理想, gRNA1效果不佳(圖1)。這提示在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)時(shí), gRNA2和gRNA3可能是更為理想的選擇。

3 討論

CRISPRs廣泛分布于細(xì)菌和古菌基因組中的一種序列[17]。研究[18,19]證實(shí)CRISPR通過(guò)產(chǎn)生RNA(crRNA)與CRISPR-associated protein相結(jié)合形成識(shí)別催化結(jié)構(gòu)，識(shí)別外源DNA序列并通過(guò)切除突變的方式達(dá)到防御自身的作用，又稱CRISPR防御體系?？茖W(xué)家將crRNA和轉(zhuǎn)錄激活transactivating RNA(tracrRNA)，它們一起形成雙鏈RNA并與Cas9結(jié)合，由RNA識(shí)別DNA序列驅(qū)動(dòng)Cas9定位后，由 Cas9內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行切割[1]。雖然CRISPR/Cas9技術(shù)的切割效率很高，而且對(duì)于gRNA設(shè)計(jì)的要求也不高，但研究人員往往面臨如何篩選多條符合基因打靶要求的gRNA。篩選一條或幾條有效的gRNA, 也是實(shí)驗(yàn)進(jìn)行順利的保證[8,9]。

本文根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)建立的這種體外篩選方法，不需特殊儀器和試劑，實(shí)用性強(qiáng)。通過(guò)將設(shè)計(jì)好的gRNA轉(zhuǎn)錄后，與含目的打靶片段的PCR產(chǎn)物，Cas9酶共同體外反應(yīng)，篩選其指導(dǎo)酶切的效率。相比轉(zhuǎn)染細(xì)胞后再進(jìn)行篩選，受精卵或胚胎顯微操作后培養(yǎng)至囊胚再基因組擴(kuò)增并測(cè)序等檢驗(yàn)策略，本方法更簡(jiǎn)單易行，適合初步篩選[20]。而且判定方法也簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器和試劑，可以在不同研究層次的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。本文中，我們以針對(duì)家兔TOR2A基因的gRNA設(shè)計(jì)與檢測(cè)的過(guò)程為例，闡述了該種方法。關(guān)于gRNA的體外篩選方法，也可在培養(yǎng)細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行，但往往需要熒光檢測(cè)儀器，對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)不是很方便，而且實(shí)驗(yàn)成本高。本文闡述的方法，實(shí)驗(yàn)條件限制小，可操作強(qiáng)，可作為基因打靶g(shù)RNA的體外篩選，是細(xì)胞系篩選的有益補(bǔ)充, 也是后期在體實(shí)驗(yàn)的保證。

當(dāng)然, 本法是在體外/細(xì)胞外進(jìn)行的篩選, 其反應(yīng)條件與體內(nèi)存在一定差異。但基于CRISPR/Cas9技術(shù)的高效率和高特異性，經(jīng)過(guò)本法篩選后，基本達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。尤其是在排除相對(duì)低效的gRNA方面，有很重要意義。根據(jù)我們的后期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也基本驗(yàn)證了初篩的效果。例如，在制作腺苷酸環(huán)化酶9(ADCY9)基因敲除兔時(shí)，通過(guò)體外篩選后，我們對(duì)新生仔兔體內(nèi)驗(yàn)證表明其敲除率為76.5% (數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。

綜上所述，我們描述了一種快速體外篩選gRNA引導(dǎo)Cas9酶切效率的方法，該方法簡(jiǎn)單可行，為研究者篩選gRNA提供了便利。

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對(duì)甲狀腺功能求得的TGI指數(shù)為:≥51歲TGI=242,女性TGI=102,已婚TGI=104?？芍挲g最大的一組對(duì)甲狀腺功能的偏好性最強(qiáng),且遠(yuǎn)超其它年齡段。在不同性別和婚姻狀況中,差異較小。

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