張小剛, 王 霞, 戴春風(fēng), 陳美蓮(上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心, 農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心(上海), 農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(上海), 上海 201708)

頭孢菌素類藥物是一種分子中含有頭孢烯的半合成廣譜類抗生素,具有臨床治療效率高、殺菌力強、過敏反應(yīng)少、毒性低等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床及畜禽飼養(yǎng)[1]。然而在畜禽飼養(yǎng)過程中,頭孢類抗生素易被濫用而引起殘留,對人類健康造成危害[2,3]。目前,測定頭孢菌素殘留量的分析方法主要有熒光分光光度法[4]、毛細管電泳法[5,6]、高效液相色譜法[7-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-15],使用較多的樣品前處理技術(shù)有液液萃取法和固相萃取法。2003年,美國化學(xué)家Anastassiades等[16]提出了一種多殘留快速、簡單、便宜、高效、耐用和安全的前處理技術(shù)QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)。QuEChERS是基于分散固相萃取建立起來的,與傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取等樣品前處理技術(shù)相比,具有分析速度快、溶劑使用量少、操作及裝置簡單且回收率好、準確度高、成本低廉的優(yōu)勢。近年來,QuEChERS及其改進方法在農(nóng)藥殘留、獸藥殘留及真菌毒素的檢測中得到了廣泛應(yīng)用[17-22]。但是,目前采用QuEChERS前處理技術(shù)提取牛奶中頭孢菌素類抗生素殘留量的相關(guān)報道則較少。

本文將QuEChERS前處理技術(shù)與超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)結(jié)合,建立了一種簡便、快速、準確同時測定牛奶中6種頭孢菌素類抗生素殘留量的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP?6500超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); Heraeus Multifuge X1R高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司); Reeko Auto EVA-20Plus全自動氮吹濃縮儀(?？苾x器有限公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

乙腈(色譜純,美國Thermo Fisher Scientific公司);醋酸(色譜純,德國CNW公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18、NH2吸附劑(天津博納艾杰爾科技有限公司)。6種頭孢菌素抗生素標準品:頭孢氨芐(cephalexin)、頭孢匹林(cephapirin)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢洛寧(cefalonium)、頭孢喹肟(cefquinome),純度不低于93.8%,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司和加拿大TRC公司。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取適量(精確至0.1 mg)6種頭孢菌素抗生素標準品,用乙腈溶解,配制質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液,于-20 ℃保存;分別準確吸取1 mL標準儲備液,置于100 mL容量瓶中,用乙腈稀釋,配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標準儲備液,于-20 ℃保存;

準確吸取0.5 mL混合標準儲備液,置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋,配制質(zhì)量濃度為0.5 mg/L的混合標準中間溶液,于-20 ℃保存。

基質(zhì)匹配標準溶液:采用1.3節(jié)樣品前處理方法制備空白牛奶樣品溶液,稀釋混合標準中間溶液,制備質(zhì)量濃度為10 μg/L的基質(zhì)匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱取5 g(精確至0.01 g)牛奶樣品,置于50 mL聚丙烯塑料離心管中,加入10 mL含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液,渦旋混勻,超聲提取10 min后,以8 000 r/min離心5 min,將上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL聚丙烯塑料離心管中,于45 ℃水浴氮吹至低于5 mL,然后用水定容至5 mL,渦旋混勻1 min。取2 mL提取液,置于15 mL聚丙烯塑料離心管中,加入100 mg C18吸附劑,渦旋混勻,以5 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾至進樣瓶中,供UPLC-MS/MS分析。

1.4 色譜條件

色譜柱:Waters HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:30 ℃;流動相:A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈;流速:0.5 mL/min。梯度洗脫程序:0～0.2 min, 5%B; 0.2～2.5 min, 5%B～95%B; 2.5～3.0 min, 95%B; 3.0～3.1 min, 95%B～5%B; 3.1～5.0 min, 5%B。進樣體積:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離(ESI)源,正離子掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度(TEM): 450 ℃;噴霧電壓(IS): 5 500 V;氣簾氣(CUR)壓力:276 Pa;霧化氣(GS1)壓力:379 Pa;輔助加熱氣(GS2)壓力:448 Pa;射入電壓(EP): 10 V;碰撞室射出電壓(CXP): 10 V。6種頭孢菌素類抗生素的其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表 1 6種頭孢菌素類抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the six cephalosporins

* Quantitative ion.

圖 1 在MRM模式下頭孢菌素類抗生素基質(zhì)匹配標準溶液(10 μg/L)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the six cephalosporins in a matrix-standard solution (10 μg/L) in MRM mode

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

頭孢菌素類抗生素屬于極性化合物,常用的色譜柱為C18色譜柱,本實驗選用了在反相條件下對極性化合物分離效果更佳的Waters HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。

乙腈和水組成的流動相具有較好的溶解性。使用ESI源時,流動相中加入適量的甲酸可以提高樣品的離子化效率。本實驗選用0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈為流動相,并優(yōu)化了梯度洗脫程序,使頭孢菌素類抗生素有較好的響應(yīng)值與峰形。6種頭孢菌素類抗生素基質(zhì)匹配標準溶液(10 μg/L)在MRM模式下的色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+模式下分別對0.5 mg/L的6種頭孢菌素類抗生素混合標準溶液進行質(zhì)譜掃描分析,得到每種化合物的分子離子峰[M+H]+,以分子離子為母離子,對其進行二級質(zhì)譜掃描,優(yōu)化每種化合物母離子和子離子所需的碰撞能量和錐孔電壓。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 提取試劑的優(yōu)化

采用QuEChERS技術(shù)進行獸藥殘留測定時,乙腈或酸化乙腈是常用的提取溶劑。本實驗選擇含醋酸的乙腈溶液作為提取劑,并對提取液中醋酸的體積分數(shù)(0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%)進行了優(yōu)化。在陰性牛奶樣品中添加6種化合物的混合標準溶液,添加水平為10 μg/kg,按本實驗建立的方法進行處理分析,結(jié)果見圖2。由圖2可知,采用含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液提取時6種目標化合物的平均回收率為80.9% ～88.0%,結(jié)果優(yōu)于其他酸度的提取劑。因此,本實驗選用含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液作為提取劑。

2.4 凈化條件的優(yōu)化

圖 3 C18吸附劑的含量對目標化合物回收率的影響Fig. 3 Effect of the content of C18 adsorbents on the recoveries of the target compound

QuEChERS技術(shù)中常用的吸附劑有C18、PSA、NH2、石墨化炭黑(GCB)等吸附劑。C18對非極性物質(zhì)有較大吸附,油脂去除效果顯著;PSA、NH2可以有效去除有機酸、糖等極性物質(zhì);GCB可以吸附色素。根據(jù)牛奶基質(zhì)的特點,本實驗比較了C18、PSA、NH2吸附劑的吸附效果。結(jié)果表明,相較于PSA和NH2吸附劑,C18具有更好的吸附效果,故選用C18作為本實驗的吸附劑。此外,進一步考察了不同吸附劑用量(50、100、200、500和1 000 mg)對6種頭孢菌素類抗生素回收率的影響(見圖3)。由圖3可知,當(dāng)C18用量為100 mg時,6種頭孢菌素類抗生素的回收率最高,因此選為實驗所用。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)主要是由于樣品在離子化時基質(zhì)成分與目標化合物相互競爭電離所致,包括基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。在LC-MS/MS定性定量分析中,基質(zhì)效應(yīng)會對儀器的靈敏度和重復(fù)性產(chǎn)生影響,進而影響檢測結(jié)果的準確性。本實驗采用(基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%的計算方法對6種頭孢菌素類抗生素的基質(zhì)效應(yīng)進行評價[23]。當(dāng)結(jié)果為正值時表示基質(zhì)增強效應(yīng),為負值時表示基質(zhì)抑制效應(yīng),絕對值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強,通常認為,基質(zhì)效應(yīng)在±20%內(nèi)為不顯著[24]。由表2可以看出,除頭孢匹林外,其余5種頭孢菌素類抗生素均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng),且基質(zhì)抑制效應(yīng)多于基質(zhì)增強效應(yīng)。為了能更準確地測定目標化合物,本實驗采用基質(zhì)匹配標準曲線來消除基質(zhì)效應(yīng)。

2.6 線性關(guān)系、檢出限與定量限

采用空白樣品基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度為2、5、10、20、50和200 μg/L的系列混合標準溶液,以質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線,得到各目標化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明,6種目標化合物在2～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,r為0.999 6～0.999 9(見表2)。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定各化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.2～0.6 μg/kg和0.8～2.0 μg/kg(見表2)。

2.7 回收率和精確度

取空白牛奶樣品,分別添加3個濃度水平的6種待測物,每個濃度水平測定6份平行樣品,考察方法的回收率和精密度,結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明,6種目標化合物在3個加標水平下的平均回收率為75.1%～94.4%,相對標準偏差(RSD)為0.6%～8.3%。

2.8 實際樣品測定

采用本實驗所建立的方法,對購自超市的10份牛奶樣品進行檢測。結(jié)果表明,所有牛奶樣品中均未檢出6種頭孢菌素類抗生素。

表 2 6種目標化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r), limits of detection (LODs),limits of quantification (LOQs) and matrix effects of the six target compounds

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 3 6種頭孢菌素類抗生素的平均回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Average recoveries and RSDs of the six cephalosporins (n=6)

3 結(jié)論

本文結(jié)合QuEChERS前處理技術(shù),建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測牛奶中6種頭孢菌素類抗生素的方法。該方法操作簡便,快速準確,靈敏度和精密度均能達到多殘留檢測技術(shù)的要求,為保障食品安全提供了技術(shù)支持。

參考文獻:

[1] Xue Y, Chen Y Y. Chinese Journal of Antibiotics, 2011, 36(2): 86

薛雨, 陳宇瑛. 中國抗生素雜志, 2011, 36(2): 86

[2] Wu W X, Gao G. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2003, 37(9): 32

吳文學(xué), 高光. 中國獸藥雜志, 2003, 37(9): 32

[3] Chien J Y, Hsueh P R, Yu C J, et al. Am J Infect Control, 2009, 37(3): 231

[4] He W L, Luo T, Zhou X, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2014, 33(1): 92

何文亮, 羅濤, 周璇, 等. 分析試驗室, 2014, 33(1): 92

[5] He D X, Meng H H, Chen D D, et al. Journal of Animal Science and Veterinary Medicine, 2008, 27(6): 5

何東旭, 孟歡歡, 陳玎玎, 等. 畜牧獸醫(yī)雜志, 2008, 27(6): 5

[6] Guo D, Chen N N, Yan Y, et al. China Pharmacy, 2005, 16(2): 135

郭丹, 陳娜娜, 晏媛, 等. 中國藥房, 2005, 16(2): 135

[7] Zhao J, Li Q N, Liu A L, et al. Journal of Nanjing Agricultural University, 2017, 40(4): 703

趙婕, 李巧寧, 劉愛玲, 等. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2017, 40(4): 703

[8] Ding D Z, Song Z Y, Luan C Z, et al. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2016, 26(2): 202

丁大中, 宋梓瑜, 欒成章, 等. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2016, 26(2): 202

[9] Xu N, Sun H X, Zhang H, et al. China Dairy Industry, 2016, 44(2): 50

許娜, 孫海新, 張慧, 等. 中國乳品工業(yè), 2016, 44(2): 50

[10] Zhang J, Zhao X R, Zhang Q, et al. Food Industry, 2016, 37(2): 269

張晶, 趙興然, 張群, 等. 食品工業(yè), 2016, 37(2): 269

[11] Lara F J, Olmo-Iruela M D, Cruces-Blanco C, et al. TrAC-Trends Anal Chem, 2012, 38: 52

[12] Cui F Y, Zhang Z H, Li J H, et al. Journal of Food Safety & Quality, 2016, 7(2): 575

崔鳳云, 張朝暉, 李建輝, 等. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2016, 7(2): 575

[13] Wang J F, Liu Y, Yang Y F, et al. Journal of Food Safety & Quality, 2015, 6(9): 3380

王建鳳, 劉艷, 楊一帆, 等. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2015, 6(9): 3380

[14] Hermo M P, Gómez-Rodríguez P, Barbosa J, et al. J Pharmaceut and Biomed, 2013, 85: 169

[15] Di Rocco M, Moloney M, O’Beirne T, et al. J Chromatogr A, 2017, 1500: 121

[16] Anastassiades M, Lehotay S J, Stajnbaher D, et al. J AOAC Int, 2003, 86(2): 412

[17] Juan C, Manes J, Font G, et al. LWT-Food Sci Technol, 2017, 86: 344

[18] Li N, Zhang Y T, Liu L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(12): 1313

李娜, 張玉婷, 劉磊, 等. 色譜, 2014, 32(12): 1313

[19] Jeong I S, Kwak B M, Ahn J H, et al. Food Chem, 2012, 133(2): 473

[20] Ruan H, Rong W G, Song N H, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(8): 1110

阮華, 榮維廣, 宋寧慧, 等. 分析化學(xué), 2014, 42(8): 1110

[21] Zheng J, Xi C X, Cao S R, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(12): 1257

鄭佳, 郗存顯, 曹淑瑞, 等. 色譜, 2017, 35(12): 1257

[22] Liu Y T, Yu L X, Wang Z Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(12): 1276

劉永濤, 余琳雪, 王楨月, 等. 色譜, 2017, 35(12): 1276

[23] Tso J, Aga D S. J Chromatogr A, 2010, 1217: 4784

[24] Gomez Perez M L, Romero-Gonzalez R, Martinez Vidal J L, et al. J Sep Sci, 2013, 36(7): 1223