劉洪斌, 姚喜梅, 田亞平, 張 鷺, 蔡英華, 姜艷彬, 李 穎*(. 中國動物疫病預(yù)防控制中心, 北京 0609; . 中國標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會, 北京 00048)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高,人們對動物源食品的需求日益增大,促使畜牧業(yè)在近幾年得到了長足發(fā)展。不同種類獸藥的使用對治療和預(yù)防動物疾病、促進(jìn)動物生長至關(guān)重要。目前我國存在養(yǎng)殖規(guī)模小而散、科學(xué)養(yǎng)殖水平低、盲目用藥現(xiàn)象多的現(xiàn)狀,導(dǎo)致了養(yǎng)殖環(huán)節(jié)藥物用量超標(biāo)、不合理休藥及人藥獸用等問題仍較嚴(yán)重。在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下,非法添加違禁藥物和功能性藥物的現(xiàn)象屢禁不止。隨著消費者對動物性產(chǎn)品質(zhì)量安全的日益關(guān)注,動物產(chǎn)品中限用及違禁藥物的檢測對保證食品安全意義重大。

目前動物性產(chǎn)品中藥物殘留檢測方法大多按藥物種類分類,如磺胺類[1,2]、喹諾酮類[3]、β-受體激動劑類[4]和大環(huán)類脂類[5]等,也有多種類藥物同時檢測的報道[6,7]。但實際生產(chǎn)中,多類藥物往往具有相似的功能或相同的副作用,如部分抗膽堿類、抗驚厥類、腎上腺素類藥物均具有口干、鈉水潴留、排尿困難等特點[8],這些副作用可間接用于注水增重以達(dá)到增收的效果。如果過量使用這些保水功能藥物,動物會出現(xiàn)煩躁不安、痙攣等神經(jīng)興奮癥狀,進(jìn)而出現(xiàn)昏迷、呼吸困難甚至死亡[9,10]。因此建立針對同一功能、特性及副作用的多種類藥物同時檢測的方法,為更好地保障食品安全、監(jiān)管藥物非法添加具有重要現(xiàn)實意義。

本實驗研究了卡馬西平、阿托品、哌侖西平和美卡拉明等15種保水功能藥物，這些藥物的研究大多見于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,內(nèi)容多為該類藥物對人體及動物的治療效果及藥物作用機(jī)理[11,12],主要檢測方法包括液相色譜法[13,14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15,16]和飛行時間質(zhì)譜法[17]等，然而檢測動物組織中這些藥物殘留方法的報道較少[18],其中多殘留同時檢測的方法還未見報道。本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測動物組織中這15種保水功能藥物殘留的方法,較好地滿足動物組織中該功能藥物殘留的檢測需求,對更好地警示非法注水、監(jiān)管動物源性食品安全和打擊非法添加提供了技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC I-CLASS超高效液相色譜儀、TQ-XS三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Waters公司); 3K15型離心機(jī)(美國Sigma公司); T25均質(zhì)機(jī)(德國IKA公司); N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司): Milli-Q純水儀(美國Millipore公司)。

普瑞巴林(pregabalin)、美卡拉明(mecamylamine)、卡馬西平(carbamazepine)、卡馬西平10,11環(huán)氧化物(carbamazepine 10,11-epoxide)、氫溴酸后馬托品(homatropine hydrobromide)、托吡卡胺(tropicamide)、阿托品(atropine)、氫溴酸東莨菪堿(scopolamine hydrobromide)、扎來普隆(zaleplon)、雙環(huán)胺(dicyclomine)、貝那替嗪(benactyzine)、依替唑侖(etizolam)、哌侖西平(pirenzepine)、丁溴酸東莨菪堿(scopolamine butylbromide)和丙哌維林(propiverine)購自百靈威科技有限公司和美侖生物技術(shù)公司,純度均>97%。乙腈、甲醇、甲酸等均為色譜純,購自美國Fisher公司;Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg/3 mL)購自美國Waters公司。豬肉、牛肉樣品購自超市和農(nóng)貿(mào)市場。

稱取適量上述標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇配制單標(biāo)準(zhǔn)儲備液,并用甲醇配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于-20 ℃保存;用初始流動相配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

提取:準(zhǔn)確稱取勻漿后的動物組織樣品2 g(精確到0.01 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液,以9 500 r/min離心5 min,取上清液于另一50 mL離心管中,再用10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液重復(fù)提取一次,合并兩次提取液,準(zhǔn)確量取10 mL,置于15 mL離心管中,待凈化。

凈化:將提取液上樣至用3 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液活化過的Oasis PRiME HLB SPE柱中,收集全部濾出液,于50 ℃氮氣吹至近干,然后用0.5 mL初始流動相定容,以12 000 r/min離心5 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,待上機(jī)測定。

1.3 色譜條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流速:0.3 mL/min;流動相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)甲醇。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 3%B, 0.5～2.5 min, 3%B～30%B; 2.5～3.5 min, 30%B, 3.5～3.6 min, 30%B～60%B, 3.6～4.5 min, 60%B, 4.5～6.0 min, 60%B～100%B, 6.0～7.5 min, 100%B, 7.5～8.5 min, 100%B～3%B; 8.5～10.5 min, 3%B。進(jìn)樣量:10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子模式(ESI+);離子源溫度:150 ℃;毛細(xì)管電壓:3.0 kV;錐孔電壓:3 V;透鏡電壓:0.5 V;脫溶劑溫度:250 ℃;錐孔氣流速:150 L/h;脫溶劑氣流速:600 L/h;碰撞氣流速:0.15 mL/min;監(jiān)測模式:MRM模式。15種保水功能藥物的母離子、子離子及其對應(yīng)的聚焦電壓和碰撞能量見表1。

表 1 15種保水功能藥物的母離子、子離子、聚焦電壓、碰撞能和保留時間Table 1 Precursor ions, product ions, focus voltages, collision energies and retention times of the 15 water-holding functional drugs

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 過濾膜種類的優(yōu)化

圖 1 不同濾膜對15種保水功能藥物吸附率的影響Fig. 1 Effect of different filters on the adsorption rates of the 15 water-holding functional drugsGHP: hydrophilic polypropylene; PTFE: polytetrafluoroethylene; PES: polyether sulfone.

濾膜過濾作為前處理過程的最后一道防線,對凈化樣品、減少基質(zhì)干擾作用明顯。濾膜對藥物的吸附作用直接影響檢測結(jié)果的回收率和準(zhǔn)確性。本文考察了Waters GHP膜、Agilent PTFE膜和尼龍膜、聚醚砜(PES)膜(天津津騰實驗設(shè)備有限公司)等4種適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液的濾膜對10 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液吸附效果的影響(見圖1)。結(jié)果顯示,4種濾膜對除普瑞巴林、托吡卡胺和阿托品外的其他12種藥物均存在不同程度的吸附,吸附率為0.7%～68.7%,其中Waters GHP膜、Agilent PTFE膜對雙環(huán)胺及丙哌維林的吸附作用較明顯;尼龍膜除對丁溴酸東莨膽堿、扎來普隆和卡馬西平10,11環(huán)氧化物的吸附作用較聚醚砜膜明顯外,其他均優(yōu)于聚醚砜膜。綜合濾膜對各藥物的吸附率和價格,選取尼龍膜作為實驗用過濾膜,但考慮到尼龍膜對部分目標(biāo)藥物也存在吸附,實驗用標(biāo)準(zhǔn)溶液也需經(jīng)濾膜過濾后上機(jī)。

圖 2 不同提取溶劑對15種保水功能藥物回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solutions on the recoveries of the 15 water-holding functional drugs

2.2 提取溶劑的選擇

在空白動物組織樣品中添加10 μg/kg 15種保水功能藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別選取甲醇、乙腈、80%(v/v)乙腈水溶液、含不同體積分?jǐn)?shù)(0.1%、0.2%、0.5%和1.0%)甲酸的乙腈溶液等7種提取溶劑,考察不同提取溶劑對提取效果的影響(見圖2)。結(jié)果表明,當(dāng)采用甲醇和80%(v/v)乙腈水溶液為提取溶劑時,蛋白質(zhì)變性沉淀不完全,樣品整體較為渾濁,且回收率較低。普瑞巴林、卡馬西平、依替唑侖、雙環(huán)胺及丙哌維林5種藥物的回收率均隨乙腈中甲酸體積分?jǐn)?shù)的升高而增加,當(dāng)甲酸的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時,雙環(huán)胺及丙哌維林兩種藥物的回收率能達(dá)到60%以上。因此實驗最終選擇含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

動物組織含有豐富的脂類、蛋白質(zhì)、肽類及其代謝產(chǎn)物等各種有機(jī)物[19],組織樣品經(jīng)處理后,仍有部分上述物質(zhì)和待測藥物以共流出物的形式同時進(jìn)入電離源,導(dǎo)致增強或抑制待測藥物的電離程度,從而產(chǎn)生不同的基質(zhì)效應(yīng)。試驗采用提取后添加法[20]測定基質(zhì)效應(yīng)。ME=目標(biāo)化合物在空白動物組織和純?nèi)軇┲械姆迕娣e之比。若ME值小于1.0,說明基質(zhì)對待測物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用;若ME值大于1.0,說明存在增強效應(yīng)。結(jié)果表明,除豬肉中哌侖西平、依替唑侖及牛肉中雙環(huán)胺的抑制效果不明顯外,其他藥物在兩種基質(zhì)中均存在不同程度的抑制效果,ME為0.70～1.05; 15種藥物在豬肉和牛肉中的基質(zhì)效應(yīng)差別不顯著(見表2)。但為減少基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果準(zhǔn)確度的影響,應(yīng)在實際檢測中采用空白基質(zhì)加標(biāo)溶液。

表 2 不同動物組織樣品中15種保水功能藥物的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of the 15 water-holding functional drugs in different animal tissue samples

2.4 線性方程和檢出限

采用1.2節(jié)方法處理空白組織樣品,添加適量15種保水功能藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/kg基質(zhì)加標(biāo)溶液,經(jīng)UPLC-MS/MS檢測,以定量離子色譜峰面積為縱坐標(biāo)、待測藥物的含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,在豬肉和牛肉組織中,15種保水功能藥物在1.0～50.0 μg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均≥0.994 9(見表3)。

用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,按3倍和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ), 15種保水功能藥物的定量限均低于1.0 μg/kg(見表3)。

2.5 回收率

取空白豬肉、牛肉組織樣品,添加含量為1.0、2.0和10 μg/kg 3個水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個水平平行測定6次,共測定3個批次,按1.2節(jié)方法進(jìn)行添加回收試驗(見表4)。豬肉中15種藥物的平均回收率為60.0%～108.2%,批內(nèi)RSD為1.09%～10.5%,批間RSD為2.31%～11.4%;牛肉中15種藥物的平均回收率為68.6%～111.0%,批內(nèi)RSD為0.56%～11.5%,批間RSD為3.65%～14.8%。方法的準(zhǔn)確度及精密度均滿足GB/T 27404-2008要求。空白豬肉樣品中添加15種保水功能藥物(10 μg/kg)的提取離子色譜圖見圖3。

表 3 15種保水抗利尿藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges, limits of detection and limits of quantification of the 15 water-holding functional drugs

y: peak area,x: mass concentration, μg/kg.

表 4 動物樣品中15種保水抗利尿藥物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Spiked recoveries and RSDs of the 15 water-holding functional drugs in animal samples

圖 3 加標(biāo)豬肉樣品中15種保水功能藥物(10 μg/kg)的提取離子色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the 15 water- holding functional drugs in blank pork samples spiked with 10 μg/kg

3 結(jié)論

本實驗針對具有相同副作用的藥物建立了UPLC-MS/MS檢測動物組織中15種保水功能藥物殘留的方法,為應(yīng)對動物源性食品中風(fēng)險隱患的篩查和監(jiān)控提供了新思路。該方法前處理快速簡單,靈敏度高,穩(wěn)定性好,能夠較好地滿足動物組織中該類藥物殘留的檢測要求,該方法的建立能有效防范藥物濫用和非法添加行為,并對打擊動物組織中非法注水提供了一定的技術(shù)支撐。

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