張 蕾， 張響英， 章敬旗， 張 揚(yáng)， 常國斌， 陳國宏， 董 飚， 吳炳鑫， 王 健

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300; 2.揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

高郵鴨是江蘇省的優(yōu)良地方畜禽品種，尤以善產(chǎn)雙黃蛋而享譽(yù)海內(nèi)外。雙黃蛋的產(chǎn)生，主要是由于禽類的2個卵泡同時成熟并排卵，而后2個卵子一同進(jìn)入輸卵管，在輸卵管內(nèi)依次被蛋白質(zhì)、殼膜以及蛋殼等物質(zhì)包裹后最終形成[1]。這一過程的觸發(fā)與家禽的卵泡發(fā)育過程密不可分[2]。迄今為止，對高郵鴨雙黃蛋性狀的調(diào)控機(jī)制未見詳細(xì)報道。

家禽的卵泡發(fā)育是由多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，在此過程中下丘腦-垂體-卵巢這一生殖軸起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。肝臟是家禽脂肪酸氧化分解的主要場所，同時也是合成脂蛋白、卵黃前體物質(zhì)的主要場所，對家禽的產(chǎn)蛋量及蛋品質(zhì)有重要的影響。已有研究結(jié)果表明，F(xiàn)SHR(卵泡刺激素受體)參與家禽卵巢的發(fā)育調(diào)節(jié)過程，并可能參與調(diào)控家禽等級卵泡的啟動[3]。ERβ(雌激素受體β)由卵巢合成和分泌，對卵巢早期發(fā)育以及卵泡的生長發(fā)育等過程起著重要作用[4]。GnRHR(生長激素受體)調(diào)控FSH的合成與釋放，從而調(diào)控卵巢的繁殖性能，有研究結(jié)果表明GnRHR與母雞雙黃蛋產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)[5]。

本研究結(jié)合前期高郵鴨個體產(chǎn)蛋記錄，篩選出雙黃蛋高、低產(chǎn)高郵鴨個體，對比兩組個體血液中激素水平，下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢組織中繁殖性能相關(guān)基因的表達(dá)，并結(jié)合卵巢組織HE染色和FSHR免疫組化染色，從組織學(xué)和分子生化水平探究雙黃蛋高、低產(chǎn)高郵鴨繁殖機(jī)能的差異性，為進(jìn)一步研究高郵鴨雙黃蛋發(fā)生的調(diào)控機(jī)制以及高郵鴨相關(guān)育種工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

試驗動物為江蘇省泰州市豐達(dá)水禽育種公司同一棟鴨舍內(nèi)單只籠養(yǎng)的330日齡高郵鴨。根據(jù)個體產(chǎn)蛋記錄篩選出雙黃蛋高、低產(chǎn)組高郵鴨個體各6只。

主要試劑：MicroElute Genomic DNA 試劑盒、Trizol regent、mirVanaTM RNA分離試劑盒(Applied Biosystem p/n AM1556)、QIAGEN RNeasy?試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LowInput Quick-Amp Labeling試劑盒、anti-FSHR(Biorbyt公司產(chǎn)品)、兔抗FSHR多克隆抗體(Zymed公司產(chǎn)品)、蘇木精、伊紅等(海南合輝公司產(chǎn)品)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用硫氰酸胍-酚-氯仿法提取各組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀測定總RNA 濃度和純度后，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA， -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血液生化指標(biāo)檢測 空腹翼靜脈采血5 ml，靜置30 min，以3 000 r/min迅速離心15 min，吸取上層血清，-20 ℃保存。全自動血液生化分析儀(Olympus Au 600)檢測血清生化指標(biāo)。

1.2.3 卵巢組織切片 試驗鴨屠宰后，取卵巢組織流水沖洗，于4%多聚甲醛中固定24 h。梯度酒精脫水后進(jìn)行石蠟包埋，5～8 μm厚度連續(xù)切片。參考姜曉龍等[6]的方法進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，參考吳馨培等[7]的方法進(jìn)行FSHR免疫組化染色。用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察高郵鴨卵巢卵泡發(fā)育情況。

1.2.4 Image pro-plus 4.5圖像分析 每只高郵鴨選取3張HE染色和FSHR免疫組化染色切片，根據(jù)卵泡發(fā)育水平，選取視野中發(fā)育階段相似的卵泡，并進(jìn)行卵泡等級分類，同時計數(shù)各級卵泡免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)量[8]。

1.2.5 Quantitative Real Time PCR(qRT-PCR) 檢測 試驗鴨屠宰后，取下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢組織，用RNeasy kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板進(jìn)行qRT-PCR。根據(jù)GenBank中收錄的鴨相關(guān)基因mRNA序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計引物[9](表1)，以β-actin基因為內(nèi)參，使用SYBR熒光定量PCR試劑盒和ABI7500 System熒光定量儀器，檢測相關(guān)基因的表達(dá)情況。

表1qRT-PCR引物信息

Table1PrimesinformationforqRT-PCR

基因 引物序列(5′→3′)退火溫度(℃)產(chǎn)物大小(bp)FSHRF：GCAAGCCCAGATTTACAGAACAGACA60128R：CAAGTGATTTAGAGGAACCAGTGAERF：CAAGTGATTTAGAGGAACCAGTGA61126R：GCAGAAGAACCTGAAAGCAACAGnRHRF：TCTGCTGGACCCCCTACTAC55107R：GCCAAAGATGAAGAGGATGTGβ?actinF：ATGCAGAAGGAGATCACAGC58167R：GAGGGTCCGGATTCATCATA

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用GraphPad Prism5統(tǒng)計學(xué)軟件，進(jìn)行兩樣本均數(shù)間t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)差異

對高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢組織切片進(jìn)行HE染色，同等倍鏡下觀察對比卵泡發(fā)育情況。結(jié)果(圖1)表明：高產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢上卵泡發(fā)育良好，卵巢上密布著小黃卵泡(6～8 mm)和大白卵泡(3～5 mm)，而低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢上小白卵泡(<2 mm)較多。高倍鏡下對各組卵泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵泡膜層和顆粒層較薄，內(nèi)外膜層分界不明顯；高產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵泡膜層較厚，內(nèi)外膜分界明顯。由此可見，高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢在組織結(jié)構(gòu)上存在明顯差異。

A、C分別為低產(chǎn)組高郵鴨卵巢×50、×100倍鏡下圖片，B、D分別為高產(chǎn)組高郵鴨卵巢×50、×100倍鏡下圖片。圖1 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢HE染色切片F(xiàn)ig.1 The HE staining slices of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck

2.2 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢FSHR免疫組化分析

對高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢組織切片進(jìn)行FSHR免疫組化染色，F(xiàn)SHR陽性細(xì)胞中顯現(xiàn)黃色或棕黃色反應(yīng)顆粒，卵巢中FSHR免疫組化陽性反應(yīng)顆粒多分布于顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞以及卵母細(xì)胞中(圖2)。低產(chǎn)組卵巢中FSHR陽性細(xì)胞染色較淺、呈淺黃色，顆粒細(xì)胞松散呈單層結(jié)構(gòu)；高產(chǎn)組卵巢中FSHR陽性細(xì)胞染色較深、呈棕黃色，顆粒細(xì)胞呈多層且排列緊密?？梢?，高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢在結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)表達(dá)上存在較大差異。

A為低產(chǎn)組；B為高產(chǎn)組。圖2 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢FSHR免疫組化染色切片(×100)Fig.2 The FSHR staining slices of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck (×100)

2.3 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨血液激素水平差異

檢測高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨血清中卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、孕酮(P)、雌二醇(E2)以及睪酮(TEST)激素水平。結(jié)果(圖3)表明：高產(chǎn)組FSH、E2和 P含量均極顯著高于低產(chǎn)蛋組(P<0.01)，而LH和TEST含量在兩組之間均無顯著差異。

a:卵泡刺激素(FSH)；b：黃體生成素(LH)；c：孕酮(P)；d：雌二醇(E2)；e：睪酮(TEST)。D為低產(chǎn)組，G為高產(chǎn)組。圖3 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨血清激素水平Fig.3 Hormonal level in high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck serum

2.4 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨繁殖性狀相關(guān)基因表達(dá)差異

采用qRT-PCR方法檢測與繁殖性狀相關(guān)的關(guān)鍵基因FSHR、ERβ和GnRHR在高郵鴨下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢中的表達(dá)。結(jié)果(圖4)表明：高產(chǎn)組高郵鴨下丘腦中FSHR表達(dá)量極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)，而ERβ表達(dá)量極顯著低于低產(chǎn)組(P<0.01)，GnRHR在兩組中的表達(dá)差異不顯著；高產(chǎn)組高郵鴨垂體及肝臟中FSHR、ERβ和GnRHR的表達(dá)量均極顯著高于低產(chǎn)組(P<0.01)；卵巢中FSHR、ERβ和GnRHR的表達(dá)量在兩組中差異不顯著。

圖4 高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨繁殖相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.4 Expression of reproduction-related genes of high and low double-yolk egg laying Gaoyou duck

3 討 論

李佳宜等[8]通過觀察東鄉(xiāng)綠殼蛋雞高、低產(chǎn)個體卵巢結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)組卵巢卵泡較低產(chǎn)組豐富，卵泡光滑而無塌陷。王巖等[10]對比高、低產(chǎn)烏雞卵巢，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)組卵泡較多，而低產(chǎn)組初級卵泡數(shù)量占多數(shù)。本試驗通過HE染色及FSHR免疫組化染色對高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢進(jìn)行對比觀察，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)組卵泡發(fā)育良好，顆粒細(xì)胞豐富且排列緊密；低產(chǎn)組卵泡發(fā)育遲緩，大量閉鎖，顆粒細(xì)胞疏松呈單層結(jié)構(gòu)。

生殖軸激素是調(diào)控家禽卵巢發(fā)育及其產(chǎn)蛋性能的主要內(nèi)分泌因子。Zhang等[11]研究結(jié)果表明FSH是調(diào)控卵泡發(fā)育的主要激素；楊淑華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，E2主要由大中型卵泡分泌，P對卵巢排卵功能具有正負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，在所檢測的5種激素中，F(xiàn)SH、E2和P在高產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨血清中的含量均顯著高于低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨，而LH和TEST無顯著差異。FSH、E2和P 3種激素之間相互協(xié)同，對高郵鴨卵巢的功能以及卵泡的發(fā)育起到綜合調(diào)控作用。

禽類的卵巢卵泡發(fā)育以及產(chǎn)蛋過程還受到多個基因的調(diào)節(jié)作用。本試驗篩選出與繁殖性狀相關(guān)的生殖激素受體基因FSHR、ERβ和GnRHR，并檢測它們在高郵鴨下丘腦、垂體、肝臟以及卵巢中的表達(dá)。結(jié)果顯示這3個基因在高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨垂體和肝臟中的mRNA表達(dá)存在極顯著差異(P<0.01)，而在卵巢中的表達(dá)量差異不顯著，F(xiàn)SHR和ERβ在下丘腦中也存在極顯著差異(P<0.01)。這與陳杰[9]研究結(jié)果相一致，F(xiàn)SHR對卵巢早期發(fā)育起重要調(diào)節(jié)作用，隨著卵泡的發(fā)育成熟，卵巢對FSH反應(yīng)的靈敏性向LH遷移，F(xiàn)SHR對卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)功能減弱。說明高郵鴨雙黃蛋產(chǎn)蛋機(jī)能與下丘腦、垂體和肝臟的調(diào)控作用密不可分。

禽類產(chǎn)蛋過程是一個復(fù)雜的發(fā)育生物學(xué)過程，受到生殖軸和生長軸激素的調(diào)節(jié)以及相關(guān)基因的調(diào)控。本試驗依據(jù)前期高郵鴨的產(chǎn)蛋記錄，篩選出高郵鴨雙黃蛋高產(chǎn)組和低產(chǎn)組，對高郵鴨雙黃蛋的產(chǎn)蛋性能進(jìn)行了探討，高、低產(chǎn)雙黃蛋高郵鴨卵巢結(jié)構(gòu)、激素水平和相關(guān)基因表達(dá)特征的對比分析結(jié)果表明高郵鴨雙黃蛋的產(chǎn)蛋機(jī)能與下丘腦、垂體和肝臟調(diào)控功能密不可分，這為進(jìn)一步研究高郵鴨雙黃蛋的產(chǎn)蛋機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)，但確切的調(diào)控機(jī)制仍需要后續(xù)更深入的研究。

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