吳利軍 周丹娜 邵志勇 金爾光 姚艷豐 王富國(guó) 陳夏冰 何斌 楊文海 劉武 童偉文 夏瑜 陳潔

摘要：為明確湖北省一規(guī)?；i場(chǎng)暴發(fā)新生仔豬腹瀉疫情的病因及病原特點(diǎn)，對(duì)采集的仔豬腹瀉樣品進(jìn)行了大腸桿菌（Escherichia coli）的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、血清型鑒定和耐藥性分析。結(jié)果表明，從仔豬腹瀉樣品中分離鑒定出22株大腸桿菌。對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定，共出現(xiàn)19株定型，分屬于O4、O38、O55、O76、O119 5個(gè)血清型，其中O4、O55、O119為優(yōu)勢(shì)血清型；藥敏測(cè)試結(jié)果顯示，分離菌株均為多重耐藥株，最少對(duì)6種藥物耐受，最高達(dá)19種。分離株對(duì)20種抗生素的耐藥率為13.6%～95.5%。敏感性最高的抗菌藥物為磷霉素，敏感率為77.3%；檢測(cè)獲得的豬場(chǎng)仔豬腹瀉大腸桿菌的血清型和耐藥譜基本數(shù)據(jù)，為制定有針對(duì)性地治療和防控方案提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：新生仔豬；腹瀉；大腸桿菌（Escherichia coli）；血清型鑒定；耐藥性

中圖分類號(hào)：S857.3+1：S852.61+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）06-0094-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.06.023

Abstract： In order to investigate the causative agents and pathogenic characteristics of newborn piglets diarrhea outbroke in a large scale pig farm of Hubei province， the study was carried out to isolate and identify Escherichia coli from the feces of diarrheal piglets and the serotype， biochemical test and drug resistance test were conducted. The results showed that 22 strains of E. coli have been isolated from the feces samples. Serological identification results showed that 19 strains were serotyped and belonged to 5 serotypes， including O4， O38， O55， O76， O119， among which the predominant serotypes were O4， O55， O119. Drug resistance analysis showed that all of the strains were multiple drug resistance. The isolates showed the least resistance to 6 kinds of antibiotics， the most resistance to 19 kinds of antibiotics. The drug resistance rate of isolates to 20 antibiotics ranged from 13.6% to 95.5%. The most sensitive antibiotic was fosfomycin and sensitive rate reached to 77.3%. In summary， our results provided the fundamental date of serotype and drug resistance of the E.coli isolates， which provided the scientific data for clinical treatment and prevention and control of diarrhea diseases in this farm.

Key words： newborn piglet； diarrhea； Escherichia coli； serotype identification； drug resistance

近年來(lái)，仔豬腹瀉成為嚴(yán)重危害中國(guó)乃至全球養(yǎng)豬業(yè)的常發(fā)性疾病之一。仔豬腹瀉病可造成仔豬生長(zhǎng)發(fā)育受阻，增重緩慢，死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。引發(fā)仔豬腹瀉的病原菌主要包括大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等[2，3]。其中致病性大腸桿菌是引發(fā)仔豬腹瀉的重要病原之一，而引發(fā)新生仔豬腹瀉的大腸桿菌主要是腸毒素性大腸桿菌（ETEC），臨床上主要表現(xiàn)為仔豬黃白痢[4]。目前，仔豬黃白痢的防治仍然以抗菌藥物為主，但隨著抗菌藥物的大量使用和不合理應(yīng)用，造成大腸桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，而耐藥菌株的流行又使得新生仔豬腹瀉更加難以防控[5]。2017年8月，湖北省一規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生新生仔豬腹瀉，臨床表現(xiàn)為仔豬脫水、腹瀉、排黃白色液體稀便，根據(jù)臨床癥狀及流行特點(diǎn)初步判定為大腸桿菌病。試驗(yàn)從發(fā)病豬場(chǎng)腹瀉仔豬糞便樣品中分離出致瀉性大腸桿菌流行株，并對(duì)分離株進(jìn)行生化鑒定、血清型鑒定和耐藥性分析，以期為探明導(dǎo)致仔豬腹瀉的病原特征和臨床用藥提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 用無(wú)菌棉拭子通過(guò)腹瀉新生仔豬肛門采集糞便樣品33份，放入帶冰保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，于24 h內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與藥物 胰蛋白大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、生化試驗(yàn)微量發(fā)酵管、藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O抗原單因子血清購(gòu)自天津生物芯片技術(shù)有限公司；DL2000 DNA Maker、Premix Taq購(gòu)自Takara公司。藥敏測(cè)試所用的抗菌藥物有環(huán)丙沙星、四環(huán)素、紅霉素、利福平、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢他啶、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、鏈霉素、氯霉素、慶大霉素、頭孢氨芐、磷霉素、頭孢呋辛、阿莫西林、氟苯尼考、林可霉素、新霉素，均由武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離鑒定與純化 無(wú)菌操作取肛拭子樣品直接劃線于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取疑似大腸桿菌菌落連續(xù)純培養(yǎng)3代。將純化后的細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，并劃線于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，觀察菌落形態(tài)及染色特征。

1.2.2 生化特性鑒定 將純化好的大腸桿菌接種于TSB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h后取適量分別接種于葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、靛基質(zhì)、VP、MR、西蒙氏枸櫞酸鹽、尿素酶、硫化氫生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察生化反應(yīng)結(jié)果。靛基質(zhì)滴加靛基質(zhì)試劑、MR滴加MR試劑1滴觀察結(jié)果。VP滴加VP甲液2滴、VP乙液1滴，置37 ℃培養(yǎng)2 h后觀察結(jié)果。

1.2.3 大腸桿菌O抗原血清型鑒定 從經(jīng)鑒定為大腸桿菌的麥康凱瓊脂平板上挑取單菌落于5 mL 的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min、過(guò)夜搖菌18 h，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入等體積的含0.5%石炭酸的生理鹽水重懸，經(jīng)過(guò)121 ℃高壓滅菌2 h，破壞菌體的K抗原即為制備的O抗原。取10 μL冷卻的菌液和10 μL的O抗原單因子血清，在玻板上混勻，1 min之內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集的為陽(yáng)性反應(yīng)，同時(shí)取生理鹽水與待檢抗原參照上述方法混合均勻，觀察有無(wú)自凝集現(xiàn)象。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 利用K-B涂布法測(cè)定分離菌株對(duì)20種常見(jiàn)抗菌藥物的敏感性，藥敏結(jié)果判定依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS）執(zhí)行。

1.2.5 16S rRNA序列鑒定 設(shè)計(jì)合成一對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因通用型檢測(cè)引物（F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。采用菌液PCR對(duì)大腸桿菌分離菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系包括：DNA模板1.0 μL菌液，Premix Taq 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃、 5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST與GenBank中登錄的細(xì)菌基因組16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

疑似大腸桿菌的細(xì)菌分離結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)18 h后，分離菌在麥康凱瓊脂上形成圓形、光滑、邊緣整齊、隆起的粉紅色菌落（圖1-A）；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色、具有金屬光澤的小菌落（圖1-B）。取純培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色，鏡檢可見(jiàn)到革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌（圖1-C）。而且22株細(xì)菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)特征均符合大腸桿菌的描述。

2.2 生化特性鑒定

對(duì)分離出的22株細(xì)菌分別進(jìn)行了生化試驗(yàn)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可知，檢測(cè)結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性。

2.3 血清型鑒定結(jié)果

對(duì)22株分離的大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可知，22株大腸桿菌菌株有19株可定型，分屬于O4、O38、O55、O76、O119 5個(gè)血清型，其中O4、O55、O119為優(yōu)勢(shì)血清型；另有3株大腸桿菌菌株為未定型。

2.4 藥敏試驗(yàn)

用20種常用抗菌藥物對(duì)22株大腸桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出，分離菌株對(duì)很多抗菌藥物產(chǎn)生了很強(qiáng)的耐藥性，其中對(duì)四環(huán)素、紅霉素、利福平、鏈霉素、阿莫西林和林可霉素的耐藥率達(dá)到了90%以上；環(huán)丙沙星、氨芐西林、氯霉素和慶大霉素的耐藥率達(dá)到80%以上；敏感性最高的抗菌藥物為磷霉素，敏感率為77.3%；其他幾種藥物也存在不同程度的耐藥性。對(duì)大腸桿菌進(jìn)行多重耐藥性分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可知，22株分離的大腸桿菌對(duì)所供試的20種抗菌藥物均表現(xiàn)為嚴(yán)重的多重耐藥。所有菌株至少對(duì)6種藥物耐受，最高的達(dá)到19耐。其中6耐、10耐菌株所占比例都為4.5%；13耐、14耐、17耐和19耐菌株所占比例都為9.1%；8耐、12耐、15耐和18耐菌株所占的比例都為13.6%。

2.5 16S rRNA序列鑒定

對(duì)分離菌株進(jìn)行16S rRNA通用型引物擴(kuò)增，部分結(jié)果如圖3。從圖3可見(jiàn)，在大小約為1 500 bp處具有特異性擴(kuò)增條帶，與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果相符，PCR擴(kuò)增條帶經(jīng)過(guò)測(cè)序表明為大腸桿菌16S rRNA基因特異性序列。

3 討論

近年來(lái)，隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，由致病性大腸桿菌引起的仔豬黃白痢死亡率增高，成活率降低，斷奶窩重降低，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[6]。由于該病的耐藥性日益嚴(yán)重，由耐藥菌株引起的臨床感染發(fā)病率和死亡率逐漸升高。因此，開(kāi)展針對(duì)性的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)是目前集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中有效防控該病的重要手段。試驗(yàn)從湖北省一規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉的糞便樣品中分離出22株細(xì)菌，根據(jù)臨床癥狀及病原菌的形態(tài)及生化鑒定，初步判定為仔豬大腸桿菌病。

引起仔豬腹瀉的大腸桿菌血清型復(fù)雜，地區(qū)分布廣泛，而且差異性較大。試驗(yàn)對(duì)分離出的22株大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，共有19株定型，主要為分屬于O4、O38、O55、O76、O119 5個(gè)血清型，其中O4、O55、O119為優(yōu)勢(shì)血清型。國(guó)外研究表明，引起仔豬黃白痢的致病性大腸桿菌常見(jiàn)的O抗原血清型主要有O8、 O9、O45、O64、O101、O115、O138、O147、O149、O157等[7，8]。國(guó)內(nèi)學(xué)者也相繼報(bào)道了各省引起仔豬腹瀉大腸桿菌的流行血清型[9，10]。而本試驗(yàn)鑒定的優(yōu)勢(shì)血清型O4、O55、O119與上述結(jié)果不是很符合，表明不同時(shí)期不同地區(qū)大腸桿菌的流行血清型不盡相同。為此，必須定期對(duì)豬場(chǎng)仔豬致病性大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，然后選取與本場(chǎng)血清型相同的菌株制成的疫苗對(duì)母豬和仔豬進(jìn)行預(yù)防。

目前，臨床上廣泛使用抗菌藥物治療大腸桿菌等細(xì)菌性疾病。但是由于過(guò)量使用抗菌藥物導(dǎo)致大量耐藥菌株出現(xiàn)。本試驗(yàn)用20種常用抗菌藥物對(duì)22株大腸桿菌分離株進(jìn)行了耐藥性測(cè)試，結(jié)果所有菌株至少對(duì)6種藥物耐受，最高達(dá)到19耐，。耐藥性產(chǎn)生最強(qiáng)的抗生素是四環(huán)素、紅霉素、利福平、鏈霉素、阿莫西林、林可霉素，耐藥率均達(dá)到90%以上。敏感性最高的抗菌藥物為磷霉素，敏感率為77.3%。說(shuō)明從該豬場(chǎng)分離的大腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，并且以多重耐藥性為主，這與國(guó)內(nèi)方雨玲等[11]和郭瀟木等[12]的報(bào)道基本一致。所以，豬場(chǎng)要定期對(duì)致病性大腸桿菌進(jìn)行藥敏監(jiān)測(cè)，在治療的過(guò)程中選擇有效的藥物和適當(dāng)?shù)膭┝浚⒅贫ê侠淼闹委煼桨竵?lái)控制仔豬大腸桿菌性腹瀉。

仔豬腹瀉病因復(fù)雜，主要包括傳染性因素和非傳染性因素。傳染性因素包括細(xì)菌和病毒兩大類致病因素，非傳染性因素包括飼養(yǎng)管理水平、圈舍環(huán)境不良、剛斷奶仔豬過(guò)度采食或者過(guò)度限飼等。因此，對(duì)于仔豬腹瀉應(yīng)及時(shí)送檢病料，明確病因，采取綜合措施進(jìn)行預(yù)防和控制。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)仔豬腹瀉大腸桿菌分離鑒定及血清型與耐藥性分析，掌握了該豬場(chǎng)引發(fā)仔豬腹瀉的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)血清型和耐藥譜，為下一步制定有針對(duì)性的治療和防控措施提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] ZHANG W，ZHAO M，RUESCH L，et al. Prevalence of virulence genes in Escherichia coli strains recently isolated from young pigs with diarrhea in the US[J].Veterinary Microbiology，2007，123（1/3）：145-152.

[2] 劉 哲，孫 洋，紀(jì) 雪，等.仔豬腹瀉大腸桿菌流行株鑒定及毒力與耐藥性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2017，44（4）：1226-1232.

[3] SONG D，MOON H，KANG B. Porcine epidemic diarrhea：A review of current epidemiology and available vaccines[J].Clinical and Experimental Vaccine Research，2015，4（2）：166-176.

[4] 王紅寧，劉書(shū)亮.規(guī)模化豬場(chǎng)仔豬黃、白痢的防治研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21（4）：264-267.

[5] 雷連成，江文正，韓文瑜，等.致病性大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中國(guó)獸藥雜志，2001，37（1）：12-13.

[6] 王 娟.仔豬黃白痢的病因、癥狀及其防治[J].現(xiàn)代畜牧科技，2016，10（22）：116-118.

[7] DO T N，CU P H，NGUYEN H X，et al. Pathotypes and serogroups of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from pre-weaning pigs in north Vietnam[J].Journal of Medical Microbiology，2006，55（1）：93-99.

[8] SUAREZ S，PANIAQUA C，ORSKOV I，et al. Unusual serotypes of Escherichia coli from piglet diarrhea in north Spain[J].Veterinary Microbiology，1988，17（4）：375-377.

[9] 姜衛(wèi)東，黃引賢.廣東省仔豬腹瀉大腸桿菌血清型鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18（1）：64-66.

[10] 劉夢(mèng)元，吳 斌，劉建杰，等.規(guī)模化豬場(chǎng)大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測(cè)及血清流行病學(xué)調(diào)查[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24（1）：16-18.

[11] 方雨玲，甘桂娥，楊宜生，等.231株仔豬腹瀉致病性大腸桿菌對(duì)18種抗菌藥物敏感性測(cè)定[J].湖北畜牧獸醫(yī)，1992（2）：1-6.

[12] 郭瀟木，楊 銅，賀丹丹，等.廣東地區(qū)豬源大腸桿菌耐藥性及其系統(tǒng)發(fā)育群的研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（1）：182-186.