王殿夫， 何 平， 王 青， 于 洋， 盧福榮， 馮華煒， 麻麗丹??

(1. 遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118000；2. 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可中心，北京 100062；3. 東港出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000；4. 丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 丹東 118000)

弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)原名為產(chǎn)氣河弧菌(Vibriofluvialis)，1983年被Brenner重新劃分為弧菌屬(Vibrio)的一個(gè)新種，為革蘭陰性稍彎曲或短桿菌，有長(zhǎng)于菌體數(shù)倍的鞘生極端鞭毛和較細(xì)的側(cè)生波狀鞭毛，有動(dòng)力[1]。弗尼斯弧菌是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者公認(rèn)的新食源性致病菌，對(duì)全球公共衛(wèi)生和食品安全造成潛在威脅，呈暴發(fā)流行或散發(fā)性急性胃腸炎。此菌存在于海洋，產(chǎn)生腸毒素，為旅游者腹瀉的病原菌之一，且會(huì)引起淺表創(chuàng)傷感染、菌血癥等疾病[2-4]。此外，該菌通過(guò)黏附和侵入宿主組織，從宿主中攝取大量營(yíng)養(yǎng)，分泌多種毒素，從而引起歐洲鰻魚(yú)(Anguillaanguilla)、對(duì)蝦(Penaeuschinensi)、文蛤(Ruditapesphilippinarum)等水產(chǎn)品的弧菌病[5-12]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中弗尼斯弧菌會(huì)導(dǎo)致文蛤細(xì)胞及組織病變，鰓絲潰爛、腸胃內(nèi)膜上皮細(xì)胞萎縮，甚至引發(fā)其暴發(fā)性死亡，也是引起對(duì)蝦發(fā)光病、紅腿病、敗血癥等疾病的主要病原之一[12-14]。因此，亟待建立靈敏、快捷、特異的檢測(cè)技術(shù)用于弗尼斯弧菌快速檢測(cè)。

目前，弗尼斯弧菌的檢測(cè)以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定為主，但是該方法檢測(cè)周期較長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要檢測(cè)人員具有專業(yè)的知識(shí)背景，遠(yuǎn)不能滿足疾病的快速診斷和及時(shí)治療。以核酸為檢測(cè)靶標(biāo)的分子檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在病原微生物的診斷和鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，但應(yīng)用PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行弗尼斯弧菌的鑒定檢測(cè)鮮有報(bào)道。toxS基因是首次發(fā)現(xiàn)于霍亂弧菌(Vibriocholerae)中的毒力基因，位于toxR基因(作為霍亂弧菌毒素操縱子的轉(zhuǎn)率激活子)的下游以增強(qiáng)toxR基因的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性[15]。toxS基因除了存在于霍亂弧菌中外，還存在于副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、費(fèi)歇爾弧菌(Vibriofischeri)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulcificus)和弗尼斯弧菌等弧菌中[16-21]。目前，toxS基因作為一個(gè)靶基因進(jìn)行弧菌屬的PCR檢測(cè)已得到廣泛應(yīng)用[21]，但是針對(duì)弗尼斯弧菌的PCR檢測(cè)尚未進(jìn)行研究。因此本研究以toxS基因?yàn)榘谢?，建立高效、特異的PCR檢測(cè)方法，用于水產(chǎn)品中弗尼斯弧菌的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 菌株

用于本研究的菌株共82株(見(jiàn)表1)，采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)買(mǎi)于ATCC、CICC、IQCC，其余菌株來(lái)自于丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局在實(shí)測(cè)樣品中分離和收集的菌株，以及來(lái)自于北京、上海、廣東、遼寧等出入境檢驗(yàn)檢疫局的樣品分離株及疾病預(yù)防控制中心的臨床分離菌株。所有菌株都經(jīng)生理生化實(shí)驗(yàn)和測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 菌株信息表Table 1 Information of bacterial strains

續(xù)表1

編號(hào)Code菌株名稱Strain來(lái)源Source地區(qū)/國(guó)別Region/Country分離時(shí)間Yearofisolation39副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)凍墨魚(yú)山東2010年40副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)病人北京2011年41副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)病人北京2011年42副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)病人北京2011年43副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)病人北京2011年44副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年45副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年46副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年47副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年48副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年49副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)肛拭子上海2009年50副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)ATCC17802美國(guó)2013年51副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)馬面魚(yú)丹東2014年52副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)腌蝦丹東2015年53霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2004年54霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2005年55霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2006年56霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2007年57霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江蟹子丹東2008年58霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2009年59霍亂弧菌(Vibriocholera)鴨綠江水丹東2009年60霍亂弧菌(Vibriocholera)沙白魚(yú)珠海2010年61霍亂弧菌(Vibriocholera)鯇魚(yú)珠海2010年62溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)鴨綠江水丹東2007年63溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)凍煮玉螺肉丹東2008年64溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)凍小魷魚(yú)丹東2008年65溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)凍小魷魚(yú)丹東2008年66溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)鹽漬毛蝦丹東2011年67溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)凍煮河螺肉丹東2011年68溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)冷凍花蝦丹東2011年69溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)病人山東2012年70溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)病人山東2012年71溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)病人山西2012年72溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)去馬面魚(yú)片丹東2014年73溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)清洗去皮馬面魚(yú)丹東2014年74溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)干調(diào)味馬面魚(yú)片丹東2014年75溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)ATCC17749美國(guó)2013年76坎氏弧菌(Vibriocampbellii)中科院微生物研究所中國(guó)2009年77大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC25922美國(guó)2010年78大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)蘇子葉及調(diào)料丹東2014年79大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)辣制蘇子葉丹東2014年80大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)醬汁黑豆丹東2014年81嗜水氣單孢菌(Aeromonashydrophila)江魚(yú)和江水丹東2007年82嗜水氣單孢菌(Aeromonashydrophila)毛蚶大連2012年83志賀氏菌(Shigellaspp)ATCC12022美國(guó)2012年

1.2 材料

江瑤貝、蜆子肉、凍雞肉及凍花菜等共384份樣品為遼寧省丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局進(jìn)出口樣品及丹東市市場(chǎng)監(jiān)測(cè)樣品。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 按照寶生物MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行DNA提取。

1.3.2 引物及探針 弗尼斯弧菌toxS基因的普通PCR引物及實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針序列見(jiàn)表2，由Invitrogen公司合成。

表2 弗尼斯弧菌普通PCR引物及實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針序列Table 2 Primers and probe used in conventional PCR and real-time fluorescence PCR assays

1.3.3 普通PCR方法及優(yōu)化 使用TaKaRa Ex Taq試劑盒，確定普通PCR方法反應(yīng)體系：模板液2 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、dNTP 0.25 μL、Taq酶0.125 μL、正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μL；以上各組分加入至0.2 mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5 000 r/min 離心10s。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，然后94 ℃ 1 min、53～61℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。并以弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 35016的基因組DNA為模板進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以條帶最亮，特異性最強(qiáng)的PCR產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)的溫度為最適退火溫度。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光PCR方法 使用ABI的Path-IDTMqPCR Master mix Kit試劑盒，確定熒光定量PCR方法反應(yīng)體系：模板液2 μL、qPCR Maser mix 12.5 μL、正向引物(10 μmol·L-1) 1 μL、反向引物(10 μmol·L-1)1 μL、探針(10 μmol·L-1) 0.3 μL，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 μL；以上各組分加入至0.2 mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5 000 r/min 離心10 s。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，然后95 ℃ 15 s、52～62 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。并以弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 35016的基因組DNA(24 CFU/mL)為模板進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn) 選取弗尼斯弧菌菌株6株、溶藻弧菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、麥?zhǔn)匣【然【鷮俸湍c桿菌科的菌株(共76株)，分別按照普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以檢驗(yàn)2種方法的特異性。

1.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn) 將弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株于3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng)18 h左右后，測(cè)其麥?zhǔn)蠞岫龋烙?jì)其菌數(shù)，然后按10倍遞增進(jìn)行梯度稀釋到10-7，取最后4個(gè)稀釋液的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)，按照相應(yīng)的方法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)取平均值確定其真實(shí)的菌密度。將已準(zhǔn)確計(jì)數(shù)的弗尼斯弧菌菌液進(jìn)行10 倍稀，分別采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法 、普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，以確定3種方法的檢測(cè)靈敏度。

1.3.7實(shí)際樣品檢測(cè) 以傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(ISO/TS 21872-2[20])為對(duì)照方法，對(duì)江瑤貝、蜆子肉、凍雞肉及凍花菜等共384份樣品分別進(jìn)行普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，并使用ABI 3500/3500xL基因測(cè)序儀對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)，以檢驗(yàn)本方法的效果。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化結(jié)果

以弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 35016的基因組DNA為模板進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。結(jié)果顯示，普通PCR方法的退火溫度為59 ℃(見(jiàn)圖1)，熒光定量PCR方法的退火溫度為60 ℃(見(jiàn)圖2)。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，普通PCR方法(標(biāo)準(zhǔn)菌株特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3，其他分離株特異性試驗(yàn)結(jié)果圖略)中的6株弗尼斯弧菌均可擴(kuò)增出150 bp大小的特異性片斷，實(shí)時(shí)熒光PCR方法(見(jiàn)圖4)中的6株弗尼斯弧菌均可擴(kuò)增出典型的擴(kuò)增曲線，而采用2種PCR方法對(duì)其余70株弧菌及腸桿菌的擴(kuò)增都呈陰性，表明2種PCR方法的特異性均為100%。

2.3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

弗尼斯弧菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.4×104CFU/mL，而DNA梯度稀釋檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖5和6)顯示，普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法對(duì)于弗尼斯弧菌的檢測(cè)靈敏度分別為2 400和24 CFU/mL，表明實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度是普通PCR檢測(cè)方法的100倍，而普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度分別是傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法的10和1 000倍。

(A:1、17：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2～4: 55 ℃；5～6：空白對(duì)照(55 ℃)；7～9：57 ℃；10～11：空白對(duì)照(57 ℃)；12～14：53 ℃退火；15～16：空白對(duì)照(53 ℃)。B: 1：Marker DL2000；2～3：59 ℃；4～5： 61 ℃；6：空白對(duì)照(59 ℃)；7：空白對(duì)照(:61℃)。A:1、17：Marker DL2000；2-4: 55 ℃；5-6：Negative control(55 ℃)；7-9：57 ℃；10-11：Negative control(57 ℃)；12-14：53 ℃退火；15-16：Negative control(53 ℃).B: 1：Marker DL2000；2-3：59 ℃；4-5： 61 ℃；6：Negative control(59 ℃)；7：Negative control(:61℃).)

圖1 普通PCR退火溫度的優(yōu)化
Fig.1 Optimization of PCR annealing temperature

(1：60 ℃；2：58 ℃；3：62 ℃；4：56 ℃)圖2 實(shí)時(shí)熒光PCR退火溫度的優(yōu)化Fig.2 Optimization of real-time fluorescence PCR annealing temperature

(1、20： DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC 35016)；3：弗尼斯標(biāo)準(zhǔn)菌株(IQCC 12301)；4：弗尼斯標(biāo)準(zhǔn)菌株(IQCC 12309)；5：弗尼斯弧菌分離株(病人)；6：弗尼斯弧菌分離株(蜆子肉)7：弗尼斯弧菌分離株(病人)；8：麥?zhǔn)匣【鷺?biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 700040)；9：河弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC 21612)；10：擬態(tài)弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CICC 21613)；11：擬態(tài)弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(IQCC 12304)；12：創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC27652)；13：哈氏弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC35084)；14：霍利斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33564)；15：坎氏弧菌分離株(毛蚶)；16：大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)；17：副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 17802)；18：志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 12022)；19陰性對(duì)照。1、20：Marker DL2000；2：Vibriofurnissiireference strain (ATCC 35016)；3：Vibriofurnissiireference strain(IQCC 12301)；4：Vibriofurnissiireference strain(IQCC 12309)；5：Vibriofurnissiiisolated strain(patient)；6：Vibriofurnissiiisolated strain(clam meat)7：Vibriofurnissiiisolated strain(patient)；8：Vibriometschnikoviireference strain(ATCC 700040)；9：Vibriofluvialisreference strain(CICC 21612)；10：Vibriominicusreference strain(CICC 21613)；11：Vibriominicusreference strain(IQCC 12304)；12：Vibriovulcificusreference strain(ATCC27652)；13：Vibrioharveyireference strain(ATCC35084)；14：Vibriohollisaereference strain(ATCC33564)；15：Vibriocampbelliiisolated strain(Anadarasubcrenata)；16：Escherichiacolireference strain(ATCC 25922)；17：Vibrioparahaemolyticusreference strain(ATCC 17802)；18：Shigellasppreference strain(ATCC 12022)；19：Negative control.)

圖3 普通PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果
Fig.3 Specificity test of conventional PCR

(1: 弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC 35016)；2：弗尼斯標(biāo)準(zhǔn)菌株(IQCC 12301)；3：弗尼斯標(biāo)準(zhǔn)菌株(IQCC 12309):4：弗尼斯弧菌分離株(病人)；5：弗尼斯弧菌分離株(蜆子肉)；6：弗尼斯弧菌分離株(病人)。1:Vibriofurnissiireference strain (ATCC 35016)；2：Vibriofurnissiireference strain(IQCC 12301)；3：Vibriofurnissiireference strain(IQCC 12309):4：Vibriofurnissiiisolated strain(patient)；5：Vibriofurnissiiisolated strain(clam meat)；6：Vibriofurnissiiisolated strain(patient).)

圖4 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果
Fig.4 Specificity test of real-time fluorescence PCR

(1、17：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2、3：2.4×108CFU/mL；4、5：2.4×107CFU/mL；6、7：2.4×106CFU/mL；8、9：2.4×105CFU/mL；10、11：2.4×104CFU/mL；12、13：2.4×103CFU/mL；14、15：2.4×102CFU/mL；16：陰性對(duì)照Negative control.)

圖5 普通PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果
Fig.5 Sensitivity test of conventional PCR

2.4 食品樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)384份樣品的檢測(cè)結(jié)果如表3所示：在258份水產(chǎn)品中，檢出弗尼斯弧菌陽(yáng)性6份樣品，這6份樣品分別來(lái)自為：牡蠣(1例)、雜色蛤(2例)、蝦(1例)、章魚(yú)(1例)、腌蟹子(1例)樣品，其余126份動(dòng)物及植物產(chǎn)品中均未檢出弗尼斯弧菌。以上所有檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)方法檢測(cè)結(jié)果一致， 6株陽(yáng)性菌株的測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖7～12)與Genbank中登錄號(hào)為：CP002377.1的弗尼斯弧菌一致性為99%～100%，證明本研究所建立2種PCR方法適用于食品中弗尼斯弧菌的檢測(cè)。

(1：2.4×106CFU/mL；2：2.4×105CFU/mL；3：2.4×104CFU/mL ；4：2.4×103CFU/mL；5： 2.4×102CFU/mL；6： 2.4×101CFU/mL)

圖6 實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity of real-time fluorescence PCR

Note: ①Number of positive samples；②Conventional PCR；③Real-time fluorescence PCR；④ISO method；⑤Aquatic products；⑥Animal products；⑦Plant products

圖7 牡蠣樣品中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)果Fig.7 Sequence alignment of Vibrio furnissii in oyster Samples

圖8 雜色蛤樣品(C1)中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)果Fig.8 Sequence alignment of Vibrio furnissii in ruditapes philippinarum Samples(C1)

圖9 雜色蛤樣品(C2)中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)果Fig.9 Sequence alignment of Vibrio furnissii in ruditapes philippinarum Samples(C2)

圖10 蝦樣品中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)果Fig.10 Sequence alignment of Vibrio furnissii in shrimp Samples

圖11 章魚(yú)樣品中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)果Fig.11 Sequence alignment of Vibrio furnissii in octopus Samples

圖12 腌蟹子樣品中弗尼斯弧菌的序列比對(duì)結(jié)Fig.12 Sequence alignment of Vibrio furnissii in pickled crab Samples

3 討論

弗尼斯弧菌廣泛存在于水體中，尤其多見(jiàn)于海產(chǎn)品中，近年來(lái)已有許多關(guān)于對(duì)蝦(Penaeuschinensis)[9]、魷魚(yú)(Squid)[21]、牡蠣(Ostreagigasthunberg)[22]等水產(chǎn)品中檢測(cè)出弗尼斯弧菌的報(bào)道，其已成為食品安全的一個(gè)重大隱患。目前，關(guān)于弗尼斯弧菌檢測(cè)的報(bào)道研究中，對(duì)于弗尼斯弧菌的檢測(cè)采均基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)及生化鑒定方法。如馬秀芝等[23]采用分離培養(yǎng)法從132份水產(chǎn)品種分離出2株弗尼斯弧菌，梁健等[24]也采用傳統(tǒng)方法從方斑東風(fēng)螺中分離出1株引起方斑東風(fēng)螺腫吻病的弗尼斯弧菌。傳統(tǒng)分離方法不僅耗時(shí)耗力，還存在檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確等問(wèn)題，不適于弗尼斯弧菌的高通量快速檢測(cè)。國(guó)內(nèi)外尚還未有弗尼斯弧菌的PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用的研究。

目前針對(duì)弧菌的特異性檢測(cè)多針對(duì)其hly、tl、toxR、toxS等毒力基因。其中toxS基因是膜整合蛋白的編碼基因，參與弧菌毒力基因的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)，廣泛存在于多種弧菌中。對(duì)toxS基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，toxS基因呈現(xiàn)出較大的種間差異性，種內(nèi)保守而種間可變的區(qū)域可作為種鑒定的良好分子靶位點(diǎn)[25]，以此建立基于弗尼斯弧菌toxs基因的特異性PCR 檢測(cè)方法。

針對(duì)PCR檢測(cè)方法的特異性試驗(yàn)的研究方面，王華麗等[26]對(duì)海產(chǎn)品中副溶血弧菌進(jìn)行了PCR檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)，采用11株副溶血弧菌和22株其他細(xì)菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)檢測(cè)。姚東瑞等[27]建立的哈氏弧菌的PCR檢測(cè)方法中，特異性試驗(yàn)采用1株哈氏弧菌及3株非哈氏弧菌進(jìn)行檢測(cè)。陳昌國(guó)等[28]建立的溶藻弧菌Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法中采用1株溶藻弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株及6株其他細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)。本研究建立的PCR方法在進(jìn)行特異性試驗(yàn)時(shí)采用了6株弗尼斯弧菌及70株其他弧菌、細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株及分離株，遠(yuǎn)高于上述文獻(xiàn)所報(bào)道的方法中采用的菌株數(shù)量，這使得菌株特異性試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果更準(zhǔn)確。

根據(jù)文獻(xiàn)[26-29]報(bào)道的PCR檢測(cè)方法，普通PCR方法檢測(cè)弧菌的靈敏度可以達(dá)到104CFU/mL數(shù)量級(jí)[26-27]，實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)弧菌的靈敏度可以達(dá)到102CFU/mL數(shù)量級(jí)[28-29]。而本研究建立的普通PCR檢測(cè)方法靈敏度分為2 400 CFU/mL，檢測(cè)靈敏度比文獻(xiàn)[26-27]報(bào)道的PCR檢測(cè)方法和ISO分離培養(yǎng)方法均高出10倍；本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度為 24 CFU/mL，檢測(cè)靈敏度比ISO分離培養(yǎng)方法高出1 000倍，與文獻(xiàn)[28-29]報(bào)道的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度基本一致。對(duì)258份食品樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，本研究建立的2種PCR方法與ISO方法的符合率達(dá)到100 %。這個(gè)結(jié)果可能是由于食品樣品中弗尼斯弧菌的感染濃度較高，因而使得這3種方法都可以檢出弗尼斯弧菌。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究建立了基于PCR技術(shù)的弗尼斯弧菌快速檢測(cè)方法，結(jié)果表明，普通PCR檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的引物和探針具有良好的特異性(100 %)，2種方法的靈敏度分別為2 400和24 CFU/mL，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度是普通PCR檢測(cè)方法的100倍。采用本研究建立的方法對(duì)384份水產(chǎn)品和食品樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，共有6份樣品檢出弗尼斯弧菌陽(yáng)性，其檢測(cè)結(jié)果與ISO方法檢測(cè)結(jié)果及測(cè)序結(jié)果一致，表明該方法適用于食品中弗尼斯弧菌的檢測(cè)。

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