程 蕾，譚明夏, 2，胡修忠，向 敏，劉曉華，余 婕，周 源，王定發(fā)

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430208，2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070 )

水牛養(yǎng)殖業(yè)在我國南方分布較為廣泛，水牛雖然全年發(fā)情但存在卵泡發(fā)育不充分、發(fā)情表現(xiàn)不明顯的特征，導(dǎo)致其受胎率普遍較低[1]。母牛單次配種后盡管受精率為90%以上，但是妊娠失敗卻高達(dá)35%～50%，是導(dǎo)致產(chǎn)犢率低下的主要原因，而絕大多數(shù)妊娠失敗(70%～80%)發(fā)生在受精后的前3周，這其中又以14～19 d母體妊娠識(shí)別時(shí)期的早期胚胎丟失為主[2-3]。血液是機(jī)體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，血常規(guī)是最基礎(chǔ)的血液檢驗(yàn)。在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)血液進(jìn)行血常規(guī)分析，可以及時(shí)監(jiān)測(cè)牛群狀態(tài)并對(duì)機(jī)體是否存在感染、貧血以及血液系統(tǒng)疾病等及早診斷，從而通過提前預(yù)防治療以及繁殖管理，降低實(shí)際生產(chǎn)中可能存在的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前，血細(xì)胞分析已被認(rèn)為是牛疾病的一種診斷工具[5]。因此，為了探究水牛早期胚胎損失的原因，本研究對(duì)14頭摩拉水牛進(jìn)行了同期發(fā)情和人工授精，通過采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的外周血樣本和血常規(guī)檢測(cè)，研究其血常規(guī)數(shù)據(jù)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。結(jié)合早期妊娠階段牛血常規(guī)數(shù)據(jù)和妊娠失敗之間的內(nèi)在關(guān)系分析，從血細(xì)胞參數(shù)變化方面對(duì)本試驗(yàn)牛群妊娠失敗的原因進(jìn)行深度分析，以便于制定相應(yīng)的預(yù)防措施減少由早期妊娠失敗帶來的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也為血液方面的研究在相關(guān)動(dòng)物繁殖和動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)牛來自于湖北省鄂州市某水牛養(yǎng)殖場(chǎng)，選取健康狀況良好、體態(tài)相近的未孕摩拉水牛14頭，用生源2+1法(寧波市三生藥業(yè)有限公司)進(jìn)行同期發(fā)情處理，并在發(fā)情后進(jìn)行人工授精，采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血液樣本進(jìn)行血常規(guī)分析。在人工授精后的第42 d利用直腸檢查和B超檢查進(jìn)行妊娠診斷，診斷結(jié)果顯示本次試驗(yàn)牛均為空懷牛。

1.2 儀器及檢測(cè)指標(biāo)

全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀ADVIA 2120i (SIEMENS)以及配套試劑，儀器開機(jī)后按照操作規(guī)程利用血液分析儀質(zhì)控品(正常值)即3-in-1 TESTpointTM Hematology Controls(SIEMENS)首先對(duì)血液學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度和準(zhǔn)確性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，確保儀器工作正常后，在物種“牛(bovine)”模式下對(duì)水牛的五分類血液參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)見表1。

表1 牛全血參數(shù)指標(biāo)及其參考范圍

1.3 樣本采集、預(yù)處理和上機(jī)檢測(cè)

采集人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血液樣本。采血均在上午進(jìn)行，采血前對(duì)保定牛的耳面進(jìn)行消毒處理，耳靜脈采血0.5～1 mL置于2 mL EDTA抗凝管中輕輕混勻，低溫保存并運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。利用全自動(dòng)五分類血細(xì)胞分析儀分析血液中WBC(白細(xì)胞絕對(duì)值)、NEU(嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)值)、LYM(淋巴細(xì)胞絕對(duì)值)、RBC(紅細(xì)胞)和PLT(血小板)等血液參數(shù)。上機(jī)前所有樣本平衡至室溫，血常規(guī)檢測(cè)于采樣當(dāng)天完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析和處理

2 結(jié)果

2.1 妊娠失敗摩拉水牛白細(xì)胞變化情況

人工授精后各時(shí)間點(diǎn)白細(xì)胞的各項(xiàng)數(shù)據(jù)匯如表2所示。通過與表1對(duì)比后發(fā)現(xiàn)：人工授精后0 d和18 d白細(xì)胞參數(shù)均在正常值范圍或接近正常值。人工授精后20 d、23 d和28 d除嗜中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(NEU)在正常值范圍，白細(xì)胞(WBC)、單核細(xì)胞絕對(duì)值(MONO)和淋巴細(xì)胞絕對(duì)值(LYM)均超出了正常值范圍。

表2 摩拉水牛白細(xì)胞參數(shù)變化

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

從表2可以看出，WBC在人工授精后呈上升的趨勢(shì)，并在20 d后顯著增加(P<0.05)；MONO在18 d和20 d極顯著增加(P<0.01)，但在之后的時(shí)間點(diǎn)無顯著變化，其比例在各時(shí)間點(diǎn)無顯著變化。NEU及其比例(NEU%)與0 d相比均顯著降低(P<0.05)。LYM及其比例(LYM%)均呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，其顯著性并隨著時(shí)間點(diǎn)變化，由顯著(P<0.05)變?yōu)闃O顯著(P<0.01)。

2.2 妊娠失敗摩拉水牛紅細(xì)胞變化情況

人工授精后各時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞參數(shù)如表3所示。人工授精后0 d，各紅細(xì)胞參數(shù)均在正常值的范圍或接近于正常值。而人工授精后18 d至28 d，除血紅蛋白(HGB)和紅細(xì)胞分布寬度變異數(shù)(RDW)外，其它紅細(xì)胞參數(shù)均不在正常范圍之內(nèi)。與0 d相比，人工授精后18 d及之后的時(shí)間點(diǎn)，紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和紅細(xì)胞壓積(HCT)均極顯著下降(P<0.01)；紅細(xì)胞平均體積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)和RDW均極顯著上升(P<0.01)；各時(shí)間點(diǎn)HGB無顯著變化。

2.3 妊娠失敗摩拉水牛血小板變化情況

從表4可看出，試驗(yàn)期間平均血小板體積(MPV)無顯著變化。與人工授精后0 d相比，18 d和20 d的血小板數(shù)(PLT)顯著降低(P<0.05)，23 d和28 d血小板數(shù)目出現(xiàn)一定量的增加；18 d、23 d和28 d的血小板分布寬度(PDW)極顯著降低(P<0.01)。

表3 摩拉水牛紅細(xì)胞參數(shù)變化

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

表4 摩拉水牛血小板參數(shù)比較

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

血常規(guī)指標(biāo)是重要的、基本的生理指標(biāo)，能直接客觀地反映出疾病的變化及進(jìn)程，在牛的健康檢測(cè)、疾病診斷以及預(yù)后中的研究和應(yīng)用越來越廣泛[6-8]。本研究檢測(cè)了妊娠失敗摩拉水牛人工授精后0 d、18 d、20 d、23 d和28 d的血常規(guī)指標(biāo)，結(jié)果顯示0 d和18 d時(shí)白細(xì)胞參數(shù)均在正常值范圍或接近正常值，提示試驗(yàn)牛在人工授精之前健康狀況良好。而WBC于人工授精后20 d及其之后顯著上升，并且超出正常值范圍；同時(shí)NEU顯著下降，MONO和LYM顯著上升。單核細(xì)胞因含有較多的非特異性脂酶，能吞噬異物產(chǎn)生抗體，有非特異性防御和保護(hù)作用，但牛血液中單核細(xì)胞的數(shù)量容易發(fā)生變化，故不能作為疾病的敏感指示劑[9]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，MONO比例在整個(gè)試驗(yàn)過程中并沒有顯著變化，而且MONO絕對(duì)值上升的幅度很小，提示本次試驗(yàn)白細(xì)胞的上升主要是由LYM的升高引起。淋巴細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫活性細(xì)胞，不具有吞噬功能，主要與漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體物質(zhì)，參與機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)[10]；同時(shí)，T淋巴細(xì)胞還是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要組分，妊娠識(shí)別與妊娠建立期間，母體在一定程度上需要通過弱化其細(xì)胞免疫實(shí)現(xiàn)對(duì)早期發(fā)育胚胎的免疫耐受。牛暉等[7]報(bào)道指出，由細(xì)菌感染引起的子宮內(nèi)膜炎，患病奶牛NEU及其比例及顯著增加，LYM比例極顯著降低；同時(shí)也有報(bào)道指出病毒性疾病在臨床上多表現(xiàn)為LYM和其比例上升[11]。本試驗(yàn)中NEU及其比例及顯著降低，LYM及其比例顯著上升，提示試驗(yàn)牛人工授精之后可能存在病毒性感染。本研究中，試驗(yàn)牛群平日為放養(yǎng)與圈養(yǎng)結(jié)合，以自然交配為主，日常管理方面較弱。另外，本次試驗(yàn)在人工授精以及血液采集的過程中均要對(duì)牛進(jìn)行驅(qū)趕后綁定，對(duì)牛群而言其生活狀態(tài)可能因過多人為因素干擾對(duì)其造成了一定的應(yīng)激；而且本次試驗(yàn)血液樣本的采集集中在5月份，江南地區(qū)此時(shí)陽光強(qiáng)度和日平均氣溫已經(jīng)較高，可能會(huì)存在一定的熱應(yīng)激，這一系列活動(dòng)影響了水牛的生理機(jī)能，降低了其免疫能力和抵抗力，從而會(huì)導(dǎo)致病原體更易入侵，使得淋巴細(xì)胞大量增殖。

試驗(yàn)牛在人工授精后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的紅細(xì)胞參數(shù)顯示，與0 d相比其它各時(shí)間點(diǎn)RBC和HCT均極顯著下降(P<0.01)，且均低于正常值，表明試驗(yàn)牛在人工授精18 d之后存在貧血癥狀。范超等[12]的研究表明，奶水牛犢牛斷奶后紅細(xì)胞數(shù)降低，而且HGB顯著下降，提示可能由于斷奶使?fàn)倥．a(chǎn)生厭食、消化不良等反應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi)鐵含量降低而造成的貧血。本試驗(yàn)中HGB無顯著變化，而且都在正常范圍之內(nèi)，因此可以排除是由缺鐵而引起的貧血。同時(shí)研究結(jié)果也顯示，試驗(yàn)牛MCV和RDW均顯著增加，提示本試驗(yàn)可能由于大細(xì)胞不均一性引起的貧血[13]。而維生素或葉酸的缺乏均可引起大細(xì)胞貧血[14]，這可能由于該試驗(yàn)場(chǎng)水牛因主要以肉用為主而平日營養(yǎng)供給不足導(dǎo)致日糧營養(yǎng)水平低下，不能滿足其配種后的生理需求。

血小板是哺乳動(dòng)物血液中的有形成分之一，是由骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解而來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，具有促進(jìn)止血和傷口愈合的作用。本次試驗(yàn)中人工授精后18 d和20 d PLT顯著下降(P<0.05)，而且整個(gè)試驗(yàn)期間PLT均低于正常值范圍。血小板的大量減少會(huì)導(dǎo)致凝血功能的不足，從而出現(xiàn)出血癥狀，有報(bào)道稱血小板數(shù)量減少會(huì)使母體血液凝固不良，從而導(dǎo)致母體妊娠失敗[15]。因此，這也可能是導(dǎo)致本次試驗(yàn)牛妊娠失敗的原因之一。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)配種后妊娠失敗水牛的血常規(guī)數(shù)據(jù)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，某些關(guān)鍵血常規(guī)指標(biāo)發(fā)生了顯著變化，其中，白細(xì)胞數(shù)顯著上升主要由淋巴細(xì)胞及其比例的上升所致，暗示：試驗(yàn)水牛人工授精后對(duì)早期發(fā)育胚胎未能達(dá)到一種較好免疫耐受狀態(tài)，這與牛群應(yīng)激可能存在一定的關(guān)系；另外，授精后紅細(xì)胞數(shù)和紅細(xì)胞壓積顯著下降也說明需要進(jìn)一步改善牛群日糧供給。本研究對(duì)于通過加強(qiáng)平時(shí)繁殖管理提升母水牛受胎率具有積極的指導(dǎo)意義。

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