孕牛血清中早孕因子的分離純化與鑒定

王曉?shī)櫍悩?shù)林，張文華，張宏剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

早孕因子( early pregnancy factor，EPF)是1974年由澳大利亞學(xué)者M(jìn)orton等[1]在孕鼠血清中首次發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為EPF與妊娠相關(guān)。近年來(lái)，人們逐漸證實(shí)，EPF是由受精卵及胚胎組織分泌的具有免疫抑制及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用的分泌蛋白質(zhì)[2，3]，是妊娠早期母體乳汁中最早出現(xiàn)的一種免疫抑制因子，從受精開(kāi)始到妊娠中期， EPF在人類(lèi)及家畜母體內(nèi)都會(huì)發(fā)揮作用，并出現(xiàn)生物活性的變化，在胚胎死亡或胚胎采出后24 h～48 h內(nèi)，EPF即消失。EPF可以用于預(yù)測(cè)早期胚胎死亡與流產(chǎn)、鑒定胚胎移植效果、監(jiān)測(cè)胎兒的狀態(tài)以及食道癌診斷[4，5]。

1 材料和方法

1.1 血清來(lái)源

血清樣本取自受孕4～5個(gè)月的孕牛血，經(jīng)3 000 r/ min離心后，取上清，56 ℃、30 min滅活，20 moL/L PBS A (pH 8.0) 4℃ 透析過(guò)夜。

1.2 試劑

DEAE-Sepharos F. F，CM-Sepharose F.F，Con A-Sepharose 4B，Heparin Sepharose Cl 6B均夠自Pharmacia。

1.3 EPF活性檢測(cè)[6]用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)(Ea-RIT法)

本實(shí)驗(yàn)以RIT≥8為EPF陽(yáng)性，RIT<8為EPF陰性。

1.4 早孕因子( EPE)分離與純化

其分離純化參考Mehta等[7]的方法，并加以改進(jìn)。將20 moL/L PBS A 透析24 h的孕血清加于DEAE-Sepharose F.F離子交換層析柱上，收集DE-1，置于50 moL/L乙酸銨緩沖液(pH 5.0)中4 ℃透析過(guò)夜。將透析的DE-1上樣 CM-Sepharose F.F離子交換層析，收集透過(guò)峰CM-2，0.1 moL/L醋酸鹽緩沖液(PBS B) 4℃ 透析24 h。將透析的CM-2上樣 ConA Sepharose 4B 親和層析 ，得到透過(guò)峰ConA-1，將活性峰 ConA-1濃縮后，置于含0.1 moL/L KCL，pH 7.0，0.05 moL/L Tris-HCL緩沖液(PBS C)4℃透析24 h。將透析的ConA-1上樣Heparin Sepharose CL 6B親和層析，收集HE-2 峰。將活性峰HE-2用 PEG 20000濃縮，用去離子水4℃ 透析24 h，凍干保存。

1.5 蛋白含量測(cè)定[8]用Lowry 法。

1.6 純化結(jié)果用SDS-PAGE電泳法[9]鑒定純化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕牛血清中 EPF 的純化結(jié)果

孕牛血清通過(guò)DEAE-Sepharose F. F離子交換層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)DE-1有EPF活性,DE-1通過(guò)CM-Sepharose F.F離子交換層析出現(xiàn)三個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)CM -2有EPF活性，CM-2通過(guò)ConA Sepharose 4B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)ConA-1有EPF活性。ConA-1通過(guò)Heparin Sepharose CL 6B親和層析出現(xiàn)兩個(gè)峰，經(jīng)Ea-RIT檢測(cè)HE-2有EPF活性。

2.2 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

將懷孕4～5月的孕牛血清通過(guò)離子交換層析和親和層析蛋白分離純化技術(shù)后，對(duì)蛋白質(zhì)濃度、含量和回收率進(jìn)行了分析，同時(shí)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)對(duì)收集到的蛋白質(zhì)生物活性進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果如表1所示。

表1 孕牛血清中 EPF 蛋白含量分析

2.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果

將收集到的HE-2通過(guò)SDS-圖1：SDS-PAGE鑒定純化產(chǎn)物

圖1 PAGE進(jìn)行分析鑒定分離純化結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是從孕牛血中分離純化EPF，為制備EPF單克隆抗體做準(zhǔn)備。將孕牛血清通過(guò)DEAE-Sepharos F. F 離子交換層析、CM-Sepharose F.F離子交換層析、ConA Sepharose 4B 親和層析、Heparin Sepharose CL 6B親和層析，所得各階段物質(zhì)采用玫瑰花環(huán)抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)[10]，結(jié)果表明第一次過(guò)DEAE-Sepharos F. F離子交換柱時(shí),不吸附在離子膠上的蛋白DE-1具有EPF活性，而吸附的蛋白DE-2沒(méi)有EPF活性；過(guò)CM-Sepharose F.F離子交換柱時(shí)，用50 moL/L乙酸銨緩沖液洗下來(lái)的蛋白CM-1沒(méi)有EPF活性，用 50 moL/L NaCl 的相同乙酸銨緩沖液洗下來(lái)的蛋白CM-2有EPF活性，而用 1 moL/L NaCl的相同乙酸銨緩沖液洗脫下來(lái)的蛋白 CM-3 也沒(méi)有EPF活性，在離子交換反應(yīng)中,EPF不吸附在DEAE-Sepharos F. F離子交換膠上，EPF而吸附CM-Sepharose F.F離子交換膠上。過(guò)ConA Sepharose 4B親和層析柱時(shí)，不能與ConA Sepharose 4B 親和的蛋白ConA-1有EPF活性，能與ConA Sepharose 4B親和的蛋白ConA-2沒(méi)有EPF活性。過(guò)Heparin Sepharose CL 6B親和層析柱時(shí)，不能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-1沒(méi)有EPF活性，能與Heparin Sepharose CL 6B親和的蛋白HE-2具有EPF活性[11,12]。在親和層析過(guò)程中，由于在孕血清中存在許多種妊娠相關(guān)蛋白和激素，其中很多為糖蛋白，如α-甲胎蛋白、絨毛膜促性腺激素( HCG)、妊娠相關(guān)蛋白α-2巨球蛋白等，經(jīng)過(guò)ConA Sepharose 4B層析柱后，將這些糖蛋白[13]除去。經(jīng)過(guò)Heparin Sepharose CL 6B柱后，最后得到純化的EPF。運(yùn)用SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)蛋白條帶，相對(duì)分子量為53.6KD。目前我們通過(guò)純化早孕因子(EPF)為免疫小鼠制備早孕因子單克隆抗體，為制備出特異性強(qiáng)和純度高早孕因子單克隆抗體做準(zhǔn)備,為進(jìn)一步研制牛流產(chǎn)及不孕癥快速檢測(cè)膠體金試紙條提供條件。

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