藍(lán)莓FLC基因電子克隆及生物信息學(xué)分析

龍凌云， 毛立彥， 黃壽輝， 檀小輝， 於艷萍， 郝小玲， 龐新華

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西南寧 530001)

花是果樹極為重要的生殖器官之一，而花芽分化是果樹由營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的重要階段，對果樹的成花過程、花數(shù)量和坐果率起著關(guān)鍵作用?；ㄑ糠只脑缤砗唾|(zhì)量對農(nóng)林業(yè)果樹生產(chǎn)的產(chǎn)量、質(zhì)量有重要影響[1]。溫度是誘導(dǎo)植物花芽分化的關(guān)鍵環(huán)境因子之一，落葉果樹通常要經(jīng)歷一個(gè)較低溫度的積累量(即需冷量)才能夠正常誘導(dǎo)花芽分化和開花，需冷量不足通常會導(dǎo)致果樹花芽分化不完整，花器官畸形或嚴(yán)重?cái)∮齕2-3]。落葉果樹花芽分化機(jī)制研究起步較晚，相關(guān)研究成果主要借鑒擬南芥等模式植物的研究。植物開花有4條不同途徑，分別是依賴光周期的開花途徑、自主開花途徑、依賴春化的開花途徑和赤霉素途徑[4]。FLC(FLOWERINGLOCUSC)基因?qū)儆贛ADS-box基因家族成員，在植物開花過程中具有重要作用[5]。在擬南芥中，低溫通過對AtFLC基因的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而調(diào)控?cái)M南芥花芽分化和成花過程[6]。

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)是一種具有獨(dú)特保健作用和高營養(yǎng)價(jià)值的落葉果樹，具有廣闊的國際市場和發(fā)展?jié)摿?，我國?0世紀(jì)80年代開始開展藍(lán)莓引種和商業(yè)化栽培，現(xiàn)已推廣至東北三省、山東、浙江、云南、貴州、廣東等多個(gè)省、區(qū)，栽培范圍呈現(xiàn)由溫帶向亞熱帶、熱帶地區(qū)發(fā)展的趨勢[7-8]。藍(lán)莓作為一種溫帶落葉果樹，通過低溫春化作用達(dá)到足量需冷量是保證其花芽正常分化并提高其農(nóng)林業(yè)產(chǎn)量、質(zhì)量的關(guān)鍵[9-11]。近年來，國內(nèi)相關(guān)科研院所和高校已經(jīng)從引種栽培特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)、逆境脅迫響應(yīng)等方面對溫度如何影響藍(lán)莓花芽分化的形態(tài)和生理生化機(jī)制開展了一系列研究[12-16]，但是關(guān)于低溫調(diào)控藍(lán)莓花芽分化的春化途徑的分子機(jī)制研究較少，尤其是FLC基因響應(yīng)溫度變化調(diào)控花芽分化的春化途徑分子機(jī)制方面的研究尚未見報(bào)道。

目前，隨著多種模式植物全基因組測序的完成，眾多分子相關(guān)數(shù)據(jù)庫[如表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag，簡稱EST)數(shù)據(jù)庫]的建立以及各類生物信息學(xué)軟件的開發(fā)和應(yīng)用，使借助生物信息學(xué)手段對植物FLC基因進(jìn)行電子克隆、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析與分子進(jìn)化分析等研究，以及在較短時(shí)間內(nèi)和較低成本下獲取大量可靠的基因、 蛋白結(jié)構(gòu)與功能信

息成為可能。電子克隆技術(shù)是以物種EST、核酸序列和蛋白質(zhì)等數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，選擇相應(yīng)的生物信息學(xué)軟件，不斷對EST序列進(jìn)行相似性比對、聚類分析、組裝拼接和序列延伸，以期快速獲取功能基因的方法，具有成本低、速度快、技術(shù)要求低和針對性強(qiáng)等特點(diǎn)[17-18]，可為新基因的結(jié)構(gòu)分析、功能鑒定等分子生物學(xué)研究帶來很大便利。目前，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)等模式植物中的電子克隆方法應(yīng)用已有較多成功先例，但在藍(lán)莓中尚未見報(bào)道。本研究基于前人研究方法和藍(lán)莓EST數(shù)據(jù)庫，以已知的擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)作為探針，采用電子克隆方法獲取1個(gè)藍(lán)莓FLC基因，并對其進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，為進(jìn)一步研究藍(lán)莓FLC基因及其編碼蛋白在低溫調(diào)控的春化途徑下如何參與藍(lán)莓花芽分化和成花的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以在美國國立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，簡稱NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊的擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)為探針，采用電子克隆方法獲得藍(lán)莓FLC基因。

1.2 方法

1.2.1 電子克隆獲得藍(lán)莓FLC基因和開放閱讀框預(yù)測 以擬南芥FLC基因編碼蛋白序列(GenBank登錄號：AAN04056.1)為探針序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用tBLASTn工具，搜索藍(lán)莓EST序列數(shù)據(jù)庫。選擇BLAST獲得的相似性較高的藍(lán)莓EST序列，利用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接，將拼接后的序列作為探針反復(fù)搜索藍(lán)莓EST數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行序列拼接，直至序列無法延伸，最后獲得的序列即為電子克隆得到的藍(lán)莓FLC基因。利用NCBI提供的ORF Finder軟件，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳代碼(the genetic codes)預(yù)測藍(lán)莓FLC基因的開放閱讀框(open reading frame，簡稱ORF)。

1.2.2 藍(lán)莓FLC基因編碼蛋白序列的生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取擬南芥、葡萄(Vitisvinifera)、柑橘(Poncirustrifoliata)、可可樹(Theobromacacao)、白樺(Betulaplatyphylla)、梨樹(Pyruspyrifolia)等19種植物FLC基因，利用CLUSTAL X 2.0將它們的編碼蛋白與藍(lán)莓FLC基因編碼蛋白進(jìn)行多重序列比對，在GeneDOC中查看它們的蛋白保守序列。使用ProtParam在線軟件分析藍(lán)莓FLC基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用Protscal在線軟件分析蛋白親/疏水性；使用SOPMA在線軟件預(yù)測分析蛋白二級結(jié)構(gòu)；使用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)，并用SPDBV軟件查看預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)，進(jìn)行Ranachandran檢測。相關(guān)在線分析軟件的名稱和網(wǎng)址見表1。

表1在線分析軟件的名稱和網(wǎng)址

1.2.3 藍(lán)莓VaFLC蛋白相似性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取擬南芥、葡萄、柑橘、可可樹、白樺、梨樹等19種植物的FLC基因，用MEGA5.0軟件對它們的編碼蛋白序列和藍(lán)莓FLC基因編碼蛋白序列進(jìn)行相似性比對，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行Bootstrap校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓FLC基因的獲取和ORF預(yù)測

以擬南芥FLC基因的編碼蛋白序列作為探針，在NCBI中的藍(lán)莓EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行tBLASTn檢索，獲得26條相似性較高的EST片段，刪除冗余序列后剩下12條。利用DNAStar軟件對篩選出的EST序列進(jìn)行拼接，獲得1個(gè)contig重疊群，將獲得的contig進(jìn)行重復(fù)搜索、拼接，最終電子克隆出1條完整的藍(lán)莓FLC類基因序列，該基因cDNA全長為1 303 bp，包含1個(gè)753 bp的ORF框，起始密碼子位點(diǎn)為第 311 bp 處，終止密碼子位點(diǎn)為第1 063 bp處，編碼250個(gè)氨基酸(圖1)，編碼蛋白命名為VaFLC。

2.2 藍(lán)莓VaFLC蛋白理化性質(zhì)分析

藍(lán)莓VaFLC蛋白一級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，該蛋白分子量為2.908 08 ku， 等電點(diǎn)為7.08， 分子式為C1267H2004N368O394S12，含量最豐富的前5種氨基酸分別為亮氨酸(簡稱Leu，12.0%)、谷氨酰胺(簡稱Gln，10.4%)、谷氨酸(簡稱Glu，9.6%)、絲氨酸(簡稱Ser，7.6%)和賴氨酸(簡稱Lys，6.8%)。

2.3 藍(lán)莓VaFLC蛋白保守序列、親/疏水性、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

植物FLC類基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的重要成員[19-20]，目前已知的植物MASD-box基因產(chǎn)物絕大多數(shù)屬于植物Ⅱ型MADS-box基因，該類型基因編碼蛋白主要有4個(gè)部分組成，分別是MEF2-like MADS域、I域、K域和C域[21]。藍(lán)莓VaFLC蛋白保守序列分析(圖2)、親/疏水性預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖3)表明，藍(lán)莓VaFLC蛋白在N端第1～56aa位置的氨基酸殘基組成1個(gè)最高保守序列區(qū)域，且該區(qū)域與其他物種FLC蛋白的相似性高于90%；VaFLC蛋白在第85～156aa位置的氨基酸殘基大多數(shù)為疏水性，與其他物種FLC蛋白類似位置的氨基酸具有一定的保守性，并且該段氨基酸殘基在二級結(jié)構(gòu)上可形成3個(gè)連續(xù)的α-螺旋二級結(jié)構(gòu)(圖4)；此外，第57～84aa位置的氨基酸和C端第157～250aa位置的氨基酸殘基與其他植物FLC蛋白相似位置的相似性較差，且C端多數(shù)由疏水性氨基酸殘基構(gòu)成。上述研究結(jié)果表明，藍(lán)莓FLC基因編碼的VaFLC蛋白符合植物Ⅱ型MADS-box基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特征。此外，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示，藍(lán)莓VaFLC蛋白中α-螺旋(alpha helix)占50.8%，無規(guī)則卷曲(random coil)、延伸鏈(extended strand)、β轉(zhuǎn)角(beta turn)分別占22.4%、15.6%、11.2%，其中α-螺旋二級結(jié)構(gòu)最多，這可能與VaFLC蛋白含有K域這一特殊的保守結(jié)構(gòu)域有關(guān)。以擬南芥(Arabidopsisthaliana)中SEPALLATA3蛋白的X晶體衍射結(jié)構(gòu)[22][分子模型數(shù)據(jù)庫(MMDB)身份編號(ID)：124051)]作為模板，在SWISS-MODEL服務(wù)器上預(yù)測藍(lán)莓VaFLC蛋白部分片段的三級結(jié)構(gòu)。經(jīng)序列比對，VaFLC蛋白與模版SEPALLATA3的相似性為61.63%，符合進(jìn)行同源建模的要求[23]，說明檢索得到的SEPALLATA3晶體結(jié)構(gòu)可作為預(yù)測的VaFLC蛋白同源建模模版。由圖5可知，同源建模構(gòu)建的VaFLC蛋白在第89～174aa位置的氨基酸殘基形成的空間結(jié)構(gòu)，主鏈二面角Φ、Ψ落于虛線內(nèi)中心區(qū)域的氨基酸殘基在95%以上，落于黑線之外的主鏈二面角Φ、Ψ不足5%，絕大多數(shù)主鏈二面角Φ、Ψ均在正常范圍內(nèi)，僅有少量氨基酸殘基的二面角Φ、Ψ落于不合理區(qū)域。理論分析表明，本試驗(yàn)所構(gòu)建的VaFLC蛋白部分片段的空間結(jié)構(gòu)是合理可靠的?；诶蠄D檢測結(jié)果，由圖6可知，VaFLC蛋白的部分蛋白片段預(yù)測三維結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這符合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中關(guān)于VaFLC蛋白保守結(jié)構(gòu)K域的特征，進(jìn)一步說明本研究的電子克隆的基因?qū)儆谥参颋LC類基因。

2.4 藍(lán)莓VaFLC蛋白的相似性和進(jìn)化地位分析

利用NCBI中BLASTp程序，將藍(lán)莓VaFLC蛋白序列與擬南芥等19種植物中已知的FLC蛋白序列進(jìn)行同源比對。表2結(jié)果表明，VaFLC蛋白與其他植物的FLC蛋白具有廣泛的相似性，除與大豆的相似性為38%外，與其他15種植物的FLC蛋白都具有高于40%的相似性，其中與葡萄、柑橘具有47%的相似性，與擬南芥、可可樹、白樺具有46%的相似性，與梨樹具有45%的相似性；此外，VaFLC蛋白與這19種植物FLC蛋白在N端前56個(gè)氨基酸序列的相似性高于90%，推測它們在N端的序列具有較高同源性， 可能與它們含有相同的保守結(jié)構(gòu)域有關(guān)。

表2VaFLC與19種植物FLC的相似性比較結(jié)果

為了分析藍(lán)莓VaFLC蛋白與其他植物中已知FLC蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，筆者選取擬南芥、葡萄、柑橘、白樺、可可樹、梨樹等19種植物的FLC蛋白進(jìn)行同源比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖6可知，參與比對的植物FLC蛋白在被子植物的進(jìn)化過程中，最初形成2個(gè)分支，分別是草本植物分支、木本植物分支。其中，擬南芥、芥菜、白芥、鹽芥、山萮菜、蘿卜、甘藍(lán)和蘿卜的FLC蛋白在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚集于同一分支，均屬于十字花科植物，而大豆FLC蛋白在草本植物方向獨(dú)立分支與十字花科植物并列。在木本植物的進(jìn)化方向上，山核桃、胡桃、茶樹和梨樹在同一分支，柑橘、娑羅雙和可可樹在同一分支，而葡萄、白樺、咖啡樹和藍(lán)莓的FLC蛋白分別形成獨(dú)立分支，推測藍(lán)莓FLC基因在進(jìn)化過程中還保留了部分原始特征。

3 討論與結(jié)論

植物FLC基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的重要成員，在低溫需求型植物(如落葉植物)花芽分化和成花過程中起著關(guān)鍵作用，低溫可對該類基因的轉(zhuǎn)錄及編碼蛋白表達(dá)水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控，從而促進(jìn)植物開花[24-25]。本研究基于藍(lán)莓EST數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用電子克隆方法獲得1個(gè)cDNA全長 1 303 bp，包含1個(gè)753 bp開放閱讀框，編碼250個(gè)氨基酸的藍(lán)莓FLC基因。該基因編碼蛋白在N端含有1個(gè)由56個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的高度保守結(jié)構(gòu)域(MEF2-like MADS域)，是MADS-box基因家族中植物Ⅱ型(MIKC型)的特征序列之一，可作為序列特異的DNA結(jié)合單元[26]，亦可參與MADS-box蛋白二聚化從而增強(qiáng)調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)的多樣性和增加靶標(biāo)基因的多樣性與特異性[27-28]；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼蛋白還含有1個(gè)半保守的K域，現(xiàn)有研究表明，MADS-box蛋白的K域結(jié)構(gòu)具有調(diào)節(jié)蛋白間相互作用的功能[29]。親/疏水性預(yù)測結(jié)果顯示，該區(qū)域氨基酸殘基主要由疏水性殘基構(gòu)成，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該區(qū)域可形成3個(gè)連續(xù)的 α-螺旋區(qū)，分別為K1、K2和K3區(qū)，通過對藍(lán)莓VaFLC蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，進(jìn)一步表明VaFLC蛋白在K域中確實(shí)含有大量α-螺旋，符合植物Ⅱ型(MIKC型)MADS-box基因編碼蛋白的序列特征。此外，藍(lán)莓VaFLC蛋白的C端是最不保守的區(qū)域，主要由疏水性氨基酸殘基構(gòu)成，僅含有少量保守序列。已有研究表明，MADS-box基因編碼蛋白的C端區(qū)域的變化是由進(jìn)化造成的[30-31]，這些序列主要參與蛋白復(fù)合體形成和轉(zhuǎn)錄激活的過程，推測其多樣性變化決定了MADS-box基因編碼蛋白的功能多樣性。

MADS-box基因家族成員起源于同一祖先型基因[32]，在進(jìn)化過程中大量的基因重復(fù)事件產(chǎn)生了MADS-box基因的2個(gè)譜系Ⅰ型(TypeⅠ)和Ⅱ型(TypeⅡ)，其中Ⅰ型又分為SRF型基因、植物Ⅰ型基因，Ⅱ型又分為MEF2型基因、植物Ⅱ型(MIKC型)[33]。因此，植物FLC基因及其編碼蛋白在核酸和氨基酸水平上存在高度保守性和相似性。本研究結(jié)果顯示，藍(lán)莓FLC基因編碼VaFLC蛋白與其他植物中FLC蛋白的相似性均高于40%，其中N端MEF2-like MADS保守結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列相似性比對結(jié)果均高于90%，進(jìn)一步表明植物FLC基因在早期存在一個(gè)共同的祖先型基因，而C端不保守結(jié)構(gòu)域的多樣性變化，可能是由植物Ⅱ型(MIKC型)基因進(jìn)化形成的。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，植物FLC基因編碼蛋白分為木本植物、草本植物2個(gè)分支，藍(lán)莓FLC基因編碼VaFLC蛋白位于木本植物分支上，并與葡萄、白樺和咖啡樹的FLC蛋白分別形成獨(dú)立分支，推測植物FLC基因早期起源于同一個(gè)被子植物祖先，藍(lán)莓FLC基因至今仍處于較原始狀態(tài)。

本研究基于藍(lán)莓EST數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用電子克隆成功獲得藍(lán)莓FLC基因，并對其氨基酸序列從結(jié)構(gòu)組成、理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化等方面進(jìn)行了預(yù)測和分析，研究結(jié)果為進(jìn)一步試驗(yàn)克隆藍(lán)莓FLC基因及探究其基因和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定了基礎(chǔ)。

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