MS-222麻醉劑對短須裂腹魚人工繁殖的麻醉影響

鄧龍君， 甘維熊， 劉小帥， 曾如奎， 劉明昌， 曾 焱， 朱 歐， 馮 鋼

(雅礱江流域水電開發(fā)有限公司，四川成都 610051)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用水：采用雅礱江支溝磨子溝水，符合國家二類水質(zhì)標準。經(jīng)循環(huán)水系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)處理，車間和催產(chǎn)池水溫(14.5±1)℃，pH值為8.4，溶解氧(dissolved cxygen，簡稱DO)含量≥8 mg/L。

試驗用魚：短須裂腹魚苗為錦屏·官地魚類增殖站2014年自行繁殖的魚苗，平均體長(17.9±1.7)cm，平均體質(zhì)量(50.8±15.3)g，健壯無傷，試驗前暫養(yǎng)于養(yǎng)殖缸(r=1 m)內(nèi)，試驗開始前24 h進行停食。雌親魚腹部膨大柔軟，體長44.5～64.5 cm，體質(zhì)量0.9～3.3 kg；雄親魚珠星明顯，體長37.5～48.0 cm，體質(zhì)量0.5～1.3 kg，產(chǎn)前暫養(yǎng)于25 m2的催產(chǎn)池內(nèi)，進行流水刺激，產(chǎn)卵期間不投食。

試驗藥品及儀器：魚用麻醉劑MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽)，購自上?？低∩锟萍脊?純度≥98%)。HI 9829多參數(shù)水質(zhì)測定儀，哈納沃德儀器公司；FA2004電子天平(最大稱量值=200 g，精確度=0.1 mg)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器公司；Scout SE電子天平(最大稱量值=600 g，精確度=0.01 g)，奧豪斯儀器公司。

1.2 試驗設(shè)計

在人工繁殖中，親魚在催產(chǎn)和授精時需多次重復(fù)麻醉，麻醉后的親魚在授精時會離水并于空氣中暴露一定時間，暴露時間依據(jù)卵子的排空時間而定。本研究選擇MS-222并設(shè)置40、60、70、80、100 mg/L共5個濃度，首先以魚苗為對象，測定有效麻醉濃度；其次在有效濃度中深度麻醉魚苗并于空氣中暴露2～12 min后復(fù)蘇，確定適宜的暴露時間范圍；同時在有效濃度中每隔4 h深度麻醉魚苗1次，共4次，測試反復(fù)麻醉對復(fù)蘇的影響。在此基礎(chǔ)上，以待產(chǎn)親魚為對象，測定有效濃度、空氣中暴露時間和重復(fù)麻醉對其人工繁殖和受精率的影響。

1.3 不同濃度MS-222溶液的pH值

不同濃度MS-222溶液測得的pH值見表1，可見pH值變化包含在淡水漁業(yè)水質(zhì)標準的pH值6.5～8.5范圍內(nèi)，因而各組未添加NaHCO3進行pH值調(diào)節(jié)。

表1不同濃度MS-222溶液的pH值

1.4 麻醉和復(fù)蘇判定標準

參考MS-222麻醉鱖魚研究中的麻醉和復(fù)蘇不同階段魚的行為特征[3]作為判斷標準，并結(jié)合試驗魚的實際表現(xiàn)，將麻醉和復(fù)蘇分別分為5個階段和4個階段(表2)。麻醉時間從魚被放入麻醉液中開始到麻醉A3期為止。復(fù)蘇時間從麻醉魚進入清水中開始到復(fù)蘇R3期為止，1 h內(nèi)未蘇醒判定為死亡。根據(jù)Marking等認定的理想麻醉濃度標準[8]，本試驗有效麻醉濃度設(shè)定為3 min內(nèi)麻醉，5 min內(nèi)復(fù)蘇，15 min后成活率是100%的濃度。

表2麻醉和復(fù)蘇過程分期及魚的行為特征

1.5 預(yù)試驗

(1)MS-222對魚苗的麻醉效果：依據(jù)設(shè)計濃度，準確稱取MS-222分別放入6個圓形塑料盆內(nèi)(r=23 cm)，每盆均裝有10 L潔凈的循環(huán)水，充分攪拌均勻并靜止2 min。將75尾魚苗隨機分成5組，每組15尾，分別放入以上配好的MS-222溶液中浸浴15 min后立即移出放入相同體積的循環(huán)水中進行復(fù)蘇。觀察魚的行為特征，記錄麻醉和復(fù)蘇時間，以≥8尾魚苗達到某一階段特征的時間為準，測定有效麻醉濃度，并統(tǒng)計成活率。

(2)暴露時間對深度麻醉魚苗復(fù)蘇的影響：將35尾魚苗放入有效麻醉濃度中8 min深麻，然后移出并用濕毛巾包裹魚體中后部，置于空氣中暴露0(對照)、2、4、6、8、10、12 min，之后再放入相同體積的循環(huán)水中復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇時間，每分鐘數(shù)用魚5尾，并統(tǒng)計復(fù)蘇率。

(3)反復(fù)麻醉對深度麻醉魚苗復(fù)蘇的影響：將5尾魚苗放入有效麻醉濃度中8 min深麻，然后移出并用濕毛巾包裹魚體中后部，置于空氣中暴露6 min后放入相同體積的循環(huán)水中復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇時間。每間隔4 h重復(fù)麻醉1次，連續(xù)麻醉4次。

1.6 MS-222對親魚人工繁殖的影響

3月19日挑選一批短須裂腹魚親魚，20日19：00用有效麻醉濃度的MS-222將其麻醉后一次性注射促黃體激素釋放激素類似物A2型(LHRH-A2)(16 μg/kg)、馬來酸地歐酮(DOM)(5 mg/kg)和絨毛膜促性腺激素(HCG)(1 400 IU/kg)，23日 08：30 挑選臨產(chǎn)雌魚8尾，配對雄魚8尾，隨機分為2組。麻醉組采取單對試驗法，將1對雌雄親魚放入有效濃度中麻醉，觀察魚的行為特征，記錄麻醉時間；將進入麻醉期的親魚移出并計時，用濕毛巾包裹并拭干，實施采卵授精，記錄離水拭干和卵子排空時間；延長親魚在空氣中暴露時間至4 min，然后立即放入清水中進行復(fù)蘇，記錄復(fù)蘇時間。對照組親魚不麻醉，直接采卵授精。授精后將受精卵清洗3次并脫黏放入孵化框中孵化，統(tǒng)計受精率。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示。采用Excel進行回歸分析，結(jié)果以回歸方程和相關(guān)系數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS-222對魚苗的麻醉效果

由表3可知，隨著濃度的增加，麻醉時間呈現(xiàn)遞減，而復(fù)蘇時間呈現(xiàn)增加的變化趨勢，各組魚苗在浸浴15 min后全部存活，24 h后無一死亡。40 mg/L濃度下，魚苗一直處于深度鎮(zhèn)靜的A1期，在358.6 s后小部分魚苗在緩慢游動，大部分魚苗靜止不動，少數(shù)個體身體微側(cè)，使其平躺后掙扎能恢復(fù)，15 min后放入清水中迅速恢復(fù)。60 mg/L濃度下不能達到深度麻醉的A4期，70 mg/L濃度下不能達到延髓麻醉的A5期。80 mg/L濃度下麻醉時間(140.4 s)<3 min，復(fù)蘇時間(181.3 s)<5 min，而100 mg/L濃度下的復(fù)蘇時間(327.2 s)則>5 min，因此80 mg/LMS-222為魚苗的有效麻醉濃度。

2.2 暴露時間對深度麻醉魚苗復(fù)蘇的影響

深度麻醉的魚苗在暴露不同時間全部復(fù)蘇成活，由圖1可知，暴露初期，各組魚苗均呈現(xiàn)A4期深度麻醉的典型特征，魚體平躺靜止，對外界刺激無反應(yīng)。隨著暴露時間的增加，呼吸逐漸恢復(fù)，在空氣中暴露286 s后，暴露時間為6～12 min 的4個組均有1尾魚頭部或尾部上翹掙扎，隨時間延長掙扎越強烈。復(fù)蘇時間隨著暴露時間的延長呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢。暴露0 min(對照)時，復(fù)蘇時間為129.8 s，極顯著高于其他各組(P<0.01)；暴露2 min時復(fù)蘇時間為 67.8 s，顯著高于暴露4～12 min的5個組(P<0.05)；暴露10 min時復(fù)蘇時間最少， 為22.6 s， 暴露12 min時復(fù)蘇時間(37.6 s)則開始上升；但暴露4～12 min的5個組的復(fù)蘇時間差異并不顯著(P>0.05)。

表3不同濃度MS-222對魚苗的麻醉效果

注：“—”表示試驗過程中未觀察到相應(yīng)的狀態(tài)。

2.3 反復(fù)麻醉對深度麻醉魚苗復(fù)蘇的影響

反復(fù)深度麻醉魚苗的復(fù)蘇時間變化，由圖2可知，經(jīng)過4次重復(fù)麻醉后，魚苗的復(fù)蘇時間差異不顯著(P>0.05)，平均復(fù)蘇時間為30 s。

2.4 MS-222對親魚麻醉和暴露后復(fù)蘇的影響

80 mg/L MS-222對親魚麻醉和暴露4 min后復(fù)蘇的影響見表4，可見雌魚進入麻醉A3期的平均時間為 181.3 s，顯著高于雄魚(157 s)(P<0.05)，極顯著高于魚苗(140 s)(P<0.01)，雄魚也高于魚苗，但差異不顯著。暴露后復(fù)蘇，雌魚達到復(fù)蘇R3期的平均時間為135.5 s，顯著高于雄魚(101.3 s)(P<0.05)，均極顯著高于魚苗(39.4 s)(P<0.01)。雌魚的麻醉時間略高于3 min，可見MS-222 80 mg/L對魚苗和親魚均能起到較好的麻醉效果，但隨著個體大小的增加，尤其是對于3 kg以上的親魚，應(yīng)適當增加麻醉劑量。

表4MS-222對親魚麻醉和暴露后復(fù)蘇的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.5 MS-222對親魚人工繁殖的影響

80 mg/L MS-222對親魚人工繁殖的影響見表5，麻醉組雌魚離水至卵子排空的平均時間為49 s，卵子排空的平均時間為25 s，分別極顯著低于對照組的83.3和50.5 s(P<0.01)；且掙扎多發(fā)生于離水拭干時，雌魚平均掙扎1.8次，尾巴左右擺動2.3次，雄魚掙扎0.6次，尾巴擺動0.4次，僅有1尾雌魚在采卵時掙扎1次，尾巴擺動1次。而對照組雌魚平均掙扎3.2次，尾巴擺動4.3次，1尾雌魚離水時劇烈掙扎并掉落在海綿墊上，3尾雌魚在采卵時掙扎；雄魚掙扎1.4次，尾巴擺動2.9次，3尾雄魚在采精時掙扎，可見麻醉后親魚的掙扎次數(shù)和強度均明顯降低。在空氣中暴露110和89 s后，雌雄親魚逐漸恢復(fù)蘇醒并翹起頭部掙扎， 隨著時間推移掙扎越強烈，尾部也擺動掙扎，甚至有騰空跳起現(xiàn)象，鰓蓋張合開度明顯大于平時，類似于人的“深呼吸”。麻醉組的平均受精率為77%，相比對照組(74.6%)差異不明顯。

表5MS-222對親魚人工繁殖的影響

注：“—”表示未麻醉對照組無相應(yīng)的狀態(tài)及數(shù)據(jù)。

3 討論

3.1 MS-222對短須裂腹魚的麻醉效果

影響MS-222麻醉效果的因素較多，但在相同條件下，濃度起著決定性作用。本試驗中，用不同濃度MS-222麻醉魚苗，麻醉時間與濃度呈負相關(guān)，復(fù)蘇時間與濃度則呈正相關(guān)。研究認為深度鎮(zhèn)靜期是運輸?shù)倪m宜時期[9]，麻醉期是操作的最佳時期[10]。當MS-222濃度為40 mg/L時，魚苗可深度鎮(zhèn)靜，但不能麻醉，故40 mg/L可作為短須裂腹魚苗運輸和親魚站內(nèi)轉(zhuǎn)運的參考濃度，但是否適宜長途運輸需進一步研究；60～100 mg/L 濃度時均能麻醉，可進行短時間的試驗和生產(chǎn)操作，但60 mg/L濃度時不能深度麻醉，故60 mg/L可作為短時間操作的安全濃度；100 mg/L濃度時麻醉時間小于 3 min，而復(fù)蘇時間比5 min長了27 s，推測90 mg/L可能也為有效麻醉濃度，尚有待進一步研究證實。這與MS-222麻醉光唇裂腹魚稚魚[7]的30～40 mg/L輕度鎮(zhèn)靜，60～70 mg/L不能深度麻醉，75～80 mg/L能深度麻醉的結(jié)論相似。

一般來說，魚的規(guī)格越大，所需麻醉劑的劑量越高。本試驗中，80 mg/L濃度時魚苗進入麻醉期的時間最短，雄親魚次之，雌親魚最長(181.3 s)且略長于3 min，故在親魚催產(chǎn)授精時可適當增加麻醉劑量，如3 kg以上的親魚可用90 mg/L。這與MS-222麻醉泥鰍[1]、施氏鱘[4]、大鯢[11]的研究得出的規(guī)格越大，進入麻醉期時間越長的結(jié)論相符。Oikawa等研究認為，仔魚期皮膚呼吸占很大比重，造成其對麻醉劑的敏感性較強；隨著生長，皮膚呼吸的相對重要性逐漸下降，而鰓呼吸逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位[12]。這可能就是光唇裂腹魚稚魚的有效麻醉濃度(60 mg/L)低于本試驗短須裂腹魚苗的主要原因，其次可能還有種間差異的緣故。

3.2 暴露時間和反復(fù)麻醉對短須裂腹魚的影響

反復(fù)麻醉試驗結(jié)果顯示，4次重復(fù)麻醉對短須裂腹魚苗的復(fù)蘇時間無顯著影響，說明在人工繁殖中可以多次使用 MS-222 重復(fù)麻醉親魚，以減少在挑選轉(zhuǎn)運、催產(chǎn)授精時造成的損傷。本試驗中，親魚在注射催產(chǎn)激素和采卵授精時的2次麻醉也充分證明了這一點。隨著魚的年齡和規(guī)格的增加，鰓呼吸逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，所需麻醉劑量也隨之增加，但經(jīng)鰓吸收的麻醉劑卻極易導(dǎo)致窒息，且復(fù)蘇率偏低[13]，故在生產(chǎn)中不可隨意增加用量和任意延長麻醉時間。

暴露試驗結(jié)果顯示，魚苗在空氣中暴露4～10 min時，復(fù)蘇時間無顯著差異。為此選擇將進入麻醉期的親魚在空氣中暴露4 min后立即復(fù)蘇，雌魚的復(fù)蘇時間最長，雄魚次之。研究表明，將麻醉后的魚體轉(zhuǎn)入清水中，MS-222由鰓、皮膚等逐漸排出體外，其完全排出的先后順序為肌肉、肝臟、腦和血液[14]。規(guī)格越大的魚，麻醉后富集的MS-222越多，推測親魚暴露于空氣中后，原本通過水體的排出通道不能順暢進行，體內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)的麻醉劑則隨著血液循環(huán)向身體其他部分分散，由此形成“神經(jīng)系統(tǒng)—肌肉—濕潤的外部環(huán)境”之間的排出通道[15]，使得神經(jīng)麻醉程度逐漸降低，魚在一定程度上恢復(fù)蘇醒，復(fù)蘇時間也隨之減少。

3.3 MS-222對短須裂腹魚人工繁殖的影響

經(jīng)麻醉后的短須裂腹魚親魚在采卵授精時，其掙扎次數(shù)和強度明顯弱于未麻醉的對照組，且主要集中于離開水體和拭干體表水分的10 s左右時間。分析原因為進入麻醉期的親魚并未完全喪失反應(yīng)能力，呼吸減弱但尚未停止，所以當親魚離水后會發(fā)生潛意識地掙扎，但麻醉作用使得魚體掙扎力不從心，促使親魚采卵時間大為縮短，人工繁殖得以流暢進行，故親魚在繁殖過程中被人為損傷的程度就會大大降低。暴露期間，雌雄親魚分別在110和89 s后開始頭部翹起掙扎，表明親魚在一定程度上已經(jīng)蘇醒并亟需水分和氧氣。因此為不影響親魚的健康，完成1組麻醉后親魚的采卵授精應(yīng)控制在 89 s 內(nèi)，并立即放入清水中進行復(fù)蘇。

受精卵的采集是增殖放流過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，影響受精率的主要因素為精卵質(zhì)量和授精方法，其次為環(huán)境因素。麻醉后的短須裂腹魚親魚在授精時還需要考慮麻醉劑的影響。Billard研究認為，麻醉劑在授精稀釋液中的濃度大于0.05%時才會影響精子的活力，麻醉劑對人工授精時產(chǎn)生不利影響的概率很低[16]。Wagner等研究認為，丁香油、MS-222和CO2麻醉虹鱒時不會影響運動精子的百分比例，但能影響精子持續(xù)運動的時間，隨著麻醉劑濃度的增加，精子持續(xù)運動的時間隨之縮短，但麻醉組受精卵的發(fā)育和孵化出苗的畸形率均與對照組無顯著差異[17]。本試驗采用干法人工授精，拭干親魚體表帶有MS-222的多余水分，以降低MS-222對精子持續(xù)運動時間的影響，統(tǒng)計分析麻醉組的受精率與對照組并無明顯差異。

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