黃顙魚(yú)病原嗜水氣單胞菌分離鑒定及致病性研究

柏愛(ài)旭， 張 科， 張敬友， 童明龍， 段宏安

(1.淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安 223001； 2.宜興出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇無(wú)錫 214200；3.連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港 222000)

黃顙魚(yú)(PesudobagrusfulvidracoRichardson)，別稱(chēng)黃臘丁、黃骨魚(yú)，在魚(yú)類(lèi)分類(lèi)學(xué)中屬鲇形目(Siluriformes)科(Bagridae)，主要分布在東亞國(guó)家。黃顙魚(yú)在我國(guó)分布廣泛，在各大水系均有分布，特別在長(zhǎng)江中下游的湖北、安徽、江蘇更為集中[1]，是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值都較高的優(yōu)質(zhì)淡水魚(yú)類(lèi)，也是出口創(chuàng)匯的優(yōu)良品種。隨著市場(chǎng)需求的增大，黃顙魚(yú)的人工養(yǎng)殖在全國(guó)各地興起。過(guò)去的幾十年中，以繁育技術(shù)、養(yǎng)殖工藝以及飼料營(yíng)養(yǎng)等為主的養(yǎng)殖技術(shù)也迅速發(fā)展。養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展降低了養(yǎng)殖成本，創(chuàng)造了更多的經(jīng)濟(jì)效益。

但是由于養(yǎng)殖密度的增加、養(yǎng)殖環(huán)境惡化，加之對(duì)于傳染性疾病防控的重視度不夠，黃顙魚(yú)出現(xiàn)了各種疾病，如病毒病、細(xì)菌病和寄生蟲(chóng)病，導(dǎo)致產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，許多中國(guó)學(xué)者對(duì)黃顙魚(yú)的紅頭病[2-4]、腹水病[5-6]、敗血癥病以及水霉病[7-8]等進(jìn)行了報(bào)道。除此之外，腸道出血病也是困擾黃顙魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的一大問(wèn)題，但是目前對(duì)于黃顙魚(yú)腸道出血病病原的報(bào)道較少。

2015年6月江蘇淮安某黃顙魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的黃顙魚(yú)出現(xiàn)大量死亡，病魚(yú)主要癥狀為腹部腫大，腸道充血，并且部分瀕死魚(yú)腹腔內(nèi)有淡黃色黏稠積液。為查明該病病因，經(jīng)細(xì)菌性病原的分離和鑒定，取患病魚(yú)的腸道和積液分離優(yōu)勢(shì)菌，最終確定病原為氣單胞菌屬(Aeromonas)。氣單胞菌屬普遍存在于自然環(huán)境中，經(jīng)常從人體、魚(yú)體、兩棲類(lèi)以及人的食物中分離到。氣單胞菌屬為條件性致病菌，在密度過(guò)大、水體污染以及缺氧等惡劣環(huán)境下，能導(dǎo)致多種魚(yú)類(lèi)發(fā)病和死亡。國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道了嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)以及維氏氣單胞菌屬(A.veronii)等菌屬引起魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生嚴(yán)重疾病[9-17]。本研究從患病養(yǎng)殖黃顙魚(yú)腸道和腹水中分離出2株優(yōu)勢(shì)致病菌(JSHA-01與JSHA-02)，采用16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對(duì)2株菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。嗜水氣單胞菌自20世紀(jì)80年代以來(lái)在多種淡水魚(yú)類(lèi)上分離到，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通過(guò)對(duì)病魚(yú)的病理切片觀察以及病原菌的回感試驗(yàn)，可分析該病原菌對(duì)黃顙魚(yú)致病的病理特征。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，為養(yǎng)殖生產(chǎn)中有效防治該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品、試驗(yàn)魚(yú)及主要試劑

病黃顙魚(yú)樣品取自江蘇淮安某養(yǎng)殖場(chǎng)；回感試驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心進(jìn)行，健康黃顙魚(yú)購(gòu)自江蘇無(wú)錫某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)15～20 cm，體質(zhì)量(60±5) g，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室玻璃水缸中。藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠純化試劑盒，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司(簡(jiǎn)稱(chēng)上海生工)。

1.2 細(xì)菌的分離純化

患病黃顙魚(yú)用滅菌生理鹽水沖洗2～3次，用經(jīng)過(guò)70%乙醇滅菌消毒的解剖工具解剖，取新鮮病灶組織(腸組織以及腸道液)，滴加少許滅菌生理鹽水，在經(jīng)過(guò)滅菌的研磨器中進(jìn)行組織勻漿，平板劃線法接種于LB平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h后，選取單個(gè)、優(yōu)勢(shì)菌落劃線純化培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌16S rRNA分子鑒定

用上海生工的細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒抽提上述2株菌基因組DNA。在氣單胞菌屬16S rRNA保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增16S rDNA序列。

正向引物：5′-GAGGTAATGGCTCACCAAGGC-3′；反向引物：5′-CGCTCGTTGCGGGACTTA-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；68 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并將其克隆到全式金pEASY-Blunt Simple克隆載體上，然后送至上海生工測(cè)序，用MEGA5軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行同源性分析。

1.4 人工感染試驗(yàn)

將分離得到的JSHA-01接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，離心菌體然后用滅菌生理鹽水分別稀釋至 5×108、5×106、5×104CFU/mL。將暫養(yǎng)1周的健康黃顙魚(yú)隨機(jī)分組，每個(gè)梯度的菌懸液接種10尾魚(yú)，每尾接種 0.2 mL；對(duì)照組黃顙魚(yú)注射等量滅菌生理鹽水，記錄發(fā)病與死亡情況，同時(shí)對(duì)接種后的發(fā)病魚(yú)的腸道及腹腔積液進(jìn)行細(xì)菌再分離純化培養(yǎng)。對(duì)剛剛死亡病魚(yú)進(jìn)行解剖觀察，并固定腸道組織用于病理切片。

1.5 藥物敏感試驗(yàn)

按照常規(guī)紙片法對(duì)經(jīng)過(guò)鑒定的菌株進(jìn)行16種常用抗生素耐藥性檢測(cè)。將JSHA-01接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，離心菌體，然后用滅菌生理鹽水重懸，制成濃度約為108CFU/mL的菌懸液。取0.1 mL菌懸液涂布于平板培養(yǎng)基上，將藥敏紙片貼于該平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抗生素抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

從腸組織和腹水中1共分離到5株優(yōu)勢(shì)菌，筆者選取其中2株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。其菌落直徑為0.5 mm左右、邊緣整齊、圓形，表面光滑、中央凸起、灰白色、不透明。同時(shí)用30%甘油保存至-80 ℃冰箱。

2.2 16S rRNA基因同源性分析

JSHA-01與JSHA-02的16S rRNA基因序列長(zhǎng)度分別為1 450、1 452 bp，通過(guò)NCBI檢索系統(tǒng)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性分析。圖1結(jié)果顯示，這2株菌屬于嗜水氣單胞菌。

2.3 分離菌的致病性

由表1可知，健康黃顙魚(yú)在接種不同梯度的病原菌菌液后死亡情況不一，病原菌濃度達(dá)到5×104CFU/mL時(shí)，死亡率在40%～50%，病原菌濃度達(dá)到5×108CFU/mL時(shí)，死亡率在90%～100%，而對(duì)照組在試驗(yàn)觀察期內(nèi)未見(jiàn)死亡。死亡黃顙魚(yú)體表正常，解剖發(fā)現(xiàn)腸道充血發(fā)紅，腹腔內(nèi)有少量黃色積液，與最初分離病原的病魚(yú)癥狀類(lèi)似。取腸道組織及腹腔積液進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)鑒定分離到的病原菌為原菌株。該病原主要引起黃顙魚(yú)腸組織病變，觀察腸組織切片(圖2)可知，感染魚(yú)腸絨毛變短變少，腸絨毛頂端開(kāi)始出現(xiàn)“溶解”，有的開(kāi)始出現(xiàn)脫落。

表1JSHA-01和JSHA-02對(duì)健康黃顙魚(yú)的感染試驗(yàn)

2.4 藥敏試驗(yàn)

采用16種常用抗生素對(duì)致病菌進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，由表2可知，分離菌JSHA-01對(duì)供試的復(fù)方新諾明、氯霉素、依諾沙星等6種抗生素敏感，對(duì)紅霉素、新霉素、氨芐西林等7種抗生素敏感中介，對(duì)新生霉素、青霉素、鏈霉素等3種藥物耐藥；分離菌JSHA-02對(duì)供試的頭孢曲松、依諾沙星、恩諾沙星等6種藥物敏感，對(duì)紅霉素、諾氟沙星、頭孢他啶等7種藥物中介，對(duì)復(fù)方新諾明、青霉素、鏈霉素等3種藥物耐藥。

表2JSHA-01和JSHA-02的藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

嗜水氣單胞菌屬普遍存在于自然環(huán)境中，經(jīng)常從人體、魚(yú)體、兩棲類(lèi)以及人的食物中分離到。氣單胞菌屬是一種條件性致病菌，存在于黃顙魚(yú)以及其他魚(yú)類(lèi)腸道與水體中[11，21-22]。魚(yú)腸道中微生物是一把雙刃劍，當(dāng)宿主利用各種防御機(jī)制將細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量控制在一定水平時(shí)，腸道微生物與宿主相互作用，但是當(dāng)這一平衡被打破時(shí)，往往能導(dǎo)致宿主疾病暴發(fā)。養(yǎng)殖環(huán)境惡化以及養(yǎng)殖生物自身免疫系統(tǒng)紊亂時(shí)，嗜水氣單胞菌大量繁殖，從而導(dǎo)致微生態(tài)的不平衡，這是細(xì)菌性疾病暴發(fā)的根源。徐伯亥等的研究證實(shí)氣單胞菌大量繁殖與腸機(jī)能的紊亂有關(guān)，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生[23-24]。因而從生產(chǎn)上建議，養(yǎng)殖者應(yīng)該適當(dāng)嚴(yán)格做好清塘工作、控制放養(yǎng)密度，保持良好水質(zhì)，提升黃顙魚(yú)養(yǎng)殖的生態(tài)環(huán)境。

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