丁 愷 ，麻鵬達，賈彥彥，裴天林，白朕卿，梁宗鎖，2

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.浙江理工大學 生命科學學院，杭州 310018)

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)為藥用模式植物，其水溶性的酚酸是發(fā)揮藥理作用的主要物質[1-3]，在臨床醫(yī)學研究中被用于治療心腦血管疾病[4]。酚酸類物質的生物合成途徑已經(jīng)得到較為清晰的闡明[5-7]。轉錄因子可以同時調控代謝途徑中多個基因，所以它成為植物次生代謝途徑遺傳改良的熱點。R2R3-MYB轉錄因子在調控植物生長發(fā)育、次生代謝、響應生物和非生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用[8-10]。R2R3-MYB可調控丹參的次生代謝，在丹參中過表達AtMYB75、SmPAP1或Rosea1，顯著提高苯丙烷代謝途徑基因的轉錄水平，進而提高迷迭香酸和丹酚酸B的含量[11-13]。在丹參毛狀根中過表達ZmC1或ZmC1/R，降低酚酸的含量[14]。

擬南芥和丹參分別有125個[15]和110個R2R3-MYB[16]。根據(jù)進化分析，擬南芥中R2R3-MYB分成22個亞族[9,15]，擬南芥和丹參的所有R2R3-MYB共分成37個亞族[16]，同一亞族的R2R3-MYB往往在代謝中發(fā)揮相似的作用[10]。Liu等[10]結合結構分析和功能分析，歸納總結不同亞族的R2R3-MYB對于植物苯丙烷代謝的影響，大多數(shù)第4亞族成員對苯丙烷代謝途徑發(fā)揮抑制作用。例如，SmMYB39可抑制丹參酚酸代謝途徑基因的表達，進而抑制迷迭香酸和丹酚酸B的積累[17]。因此，結構分析對于探討MYB轉錄因子的功能十分有參考價值。

轉錄因子的功能與其定位情況密切相關[18]，轉錄因子可在細胞核中調控基因的轉錄，也有一些轉錄因子在細胞核外發(fā)揮作用[18-19]。細胞質是許多生理過程發(fā)生的場所，比如質體中的轉錄過程。轉錄因子的功能或定位情況可能會受到其他轉錄因子的影響[19]。例如，擬南芥的AtMYC1單獨定位在細胞質，GL1單獨定位在細胞核，AtMYC1和GL1之間可以互作；當進行AtMYC1和GL1共定位研究時，二者之間出現(xiàn)互作，且這種互作導致GL1重新定位到細胞質[19]。在發(fā)揮調控作用時，R2R3-MYB可單獨作用，也可與bHLH和WD轉錄因子形成MBW復合體發(fā)揮作用[20-22]。因此，了解轉錄因子的定位情況和是否存在自激活活性，可以為探索轉錄因子的功能奠定基礎。

本研究從進化、亞細胞定位和自激活活性分析3個角度對SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的功能進行探討，為進一步研究3個轉錄因子的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 選用當季新鮮洋蔥用于亞細胞定位試驗。

丹參種子由陜西天士力公司商洛基地提供。丹參種子先用自來水浸泡12 h，再用流動自來水沖洗12 h；經(jīng)過預處理的種子在超凈臺中進行消毒，先用乙醇溶液(φ=75%)浸泡30 s，無菌水沖洗2次；再用HgCl2溶液(w=0.1%)浸泡15 min，無菌水沖洗7次；用鑷子將種子均勻平鋪在MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)于組培間(溫度約為25 ℃，光照度約為2 000 lx，光照時間為14 h)。選用2周齡丹參無菌苗，使用RNA提取試劑盒提取其總RNA，使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板進行基因克隆。

1.1.2 質粒和菌種 質粒pA7-GFP由中藥指紋圖譜與天然產(chǎn)物庫研究中心實驗室(以下簡稱本實驗室)保存；質粒pDONR207和pDEST-GBKT7由John Innes Centre的Cathie Martin教授贈予；克隆載體pMD19-T購自Invitrogen公司；酵母菌株AH109也由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α菌株感受態(tài)購自康為試劑公司。

1.1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒購自北京天根公司；反轉錄試劑盒購自Takara公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自OMEGA公司；Gateway重組反應試劑盒購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、慶大霉素和卡那霉素購自Amerosco公司；腺苷酸、組氨酸、色氨酸、3-氨基-1,2,4-三氮唑(3AT)和DAPI購自北京索萊寶公司；Taq聚合酶、T4連接酶和各限制性內(nèi)切酶(SmaI、BamH I、XhoI和SpeI)購自Thermo Fisher公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設計和基因克隆 根據(jù)NCBI的Nucleotide數(shù)據(jù)庫收錄的SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93序列，使用Primer Premier 6軟件設計引物，用于擴增上述3個基因，引物序列詳見表1，其中下劃線標注的序列為酶切位點或接頭引物序列。根據(jù)RNA提取試劑盒說明書，提取2周齡丹參小苗的全部RNA并以此為模板，根據(jù)反轉錄試劑盒說明書將其反轉錄成cDNA。使用上述模板和引物(F33/R33、F54/R54或F93/R93)進行PCR擴增、電泳檢測；根據(jù)膠回收試劑盒說明書回收目的片段，分別連接克隆載體pMD19-T和轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)過PCR驗證后送Invitrogen公司測序驗證。對測序驗證結果正確的菌株提取質粒，并分別命名為pMD19-T-SmMYB33、pMD19-T-SmMYB54和pMD19-T-SmMYB93。

1.2.2 載體構建 使用上述質粒(pMD19-T-SmMYB33、pMD19-T-SmMYB54或pMD19-T-SmMYB93)為模板，用表1中的引物(F332/R332、F542/R542、F932/R932、F333/R333、F543/R543、F933/R933)進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物用電泳檢測并回收。

使用SmaI和BamHI分別雙酶切pA7-GFP和F332/R332擴增得到的片段；使用XhoI和SpeI分別雙酶切pA7-GFP、F542/R542和F932/R932擴增得到的片段。電泳檢測并回收目的條帶，使用T4連接酶將回收的載體和目的片段進行連接；將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用含氨芐青霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗證后送Invitrogen公司測序驗證。對測序結果正確的菌株提取質粒，并分別命名為pA7-GFP-SmMYB33、pA7-GFP-SmMYB54和pA7-GFP-SmMYB93。

根據(jù)Gateway重組反應試劑盒說明書，將引物(F333/R333、F543/R543或F933/R933)擴增回收得到的片段分別與pDONR207進行BP重組反應；反應產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用含慶大霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗證后送Invitrogen公司測序驗證，對測序結果正確的菌株提取質粒，并分別命名為pDONR207-SmMYB33、pDONR207-SmMYB54和pDONR207-SmMYB93；將上述質粒分別與pDEST-GBKT7進行LR重組反應，反應產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，使用含卡那霉素的平板篩選陽性菌株；經(jīng)過PCR驗證后送Invitrogen公司測序驗證，對測序結果正確的菌株提取質粒，并分別命名為pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93。

表1 用于基因擴增的引物Table 1 Primers used for gene amplification

注:酶切位點序列用下劃線標注；同源重組臂序列用斜體標注。

Note:Underlined sequences represent restriction enzyme sites; the italic sequences represent homologous recombination arm sequences.

1.2.3 生物信息學分析 將測序得到的核苷酸和氨基酸序列在NCBI中進行BLAST，并與得分最高的序列進行比對；使用SMART和SOPMA對其結構域和二級結構進行預測；使用MUSCLE法將Rosea1(ABB83826.1)、C1(P10290.1)、SmPAP1(ACZ48688.2)、SmMYB39(AGS48990.1)、SmMYB36和擬南芥的125條R2R3-MYB氨基酸序列進行多序列比對，然后使用MEGA 7.0軟件的最大似然法構建系統(tǒng)進化樹，參數(shù)為默認值；使用雙向BLAST法尋找研究基因在擬南芥中的直系同源基因；根據(jù)進化樹結果，選取進化上相近的成員進行二級結構分析，使用Clustal X2進行序列比對和BoxShade工具呈現(xiàn)比對結果。

1.2.4 亞細胞定位分析 參考張順倉[23]的方法進行亞細胞定位試驗。選取新鮮洋蔥最內(nèi)層蔥瓣，用手術刀片將其切至1.5 cm×1.5 cm大小，快速撕取內(nèi)表皮，平鋪于MS固體培養(yǎng)基，25 ℃暗培養(yǎng)24 h。用基因槍法將質粒pA7-GFP、pA7-GFP-SmMYB33、pA7-GFP-SmMYB54和pA7-GFP-SmMYB93轉化到內(nèi)表皮，25 ℃共培養(yǎng)36 h后，用10 μg/mL DAPI染色20 min，再用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗3次，制片，用激光共聚焦掃描顯微鏡在明場、激發(fā)光405 nm和激發(fā)光488 nm下進行觀察。

1.2.5 自激活活性分析 分別轉化質粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93到酵母AH109感受態(tài)細胞，使用SD/-Trp培養(yǎng)基篩選菌株；挑取單克隆并使用SD/-Trp液體培養(yǎng)基擴繁到足夠量，提取質粒送Invitrogen公司測序驗證。將成功轉化質粒的菌液分別稀釋到原菌的1、1/10和1/100，分別在3AT濃度為0、5、10、15或20 mmol/L的SD/-Trp或SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上點斑驗證，30 ℃暗培養(yǎng)3～4 d后觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 基因克隆和鑒定

如圖1，經(jīng)PCR擴增得到738 bp的基因 SmMYB33，804 bp的基因 SmMYB54和495 bp的基因 SmMYB93。使用BLAST進行比對，發(fā)現(xiàn)測序得到序列SmMYB33的核苷酸序列(A363、C438和G654)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059387.1的序列(G363、T438和A654)有差異；測序得到的序列的氨基酸序列(G217)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52057.1的序列(D217)也有差異。測序得到序列SmMYB54的核苷酸序列(A278、G281、C429、T504和T702)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059408.1的序列(T278、T281、T429、C504和G702)有差異；測序得到的序列的氨基酸序列(V255和H258)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52078.1的序列(G255和Q258)也有差異。測序得到序列SmMYB93的核苷酸序列比數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059447.1的序列在379～380位之間多6個核苷酸(CTACTG)，測序得到的序列的氨基酸序列比數(shù)據(jù)庫中登錄號為AGN52117.1的序列在127～128位之間多2個氨基酸(TA)；此外，測序得到序列SmMYB93的核苷酸序列(G408)與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KF059447.1的序列(A408)其他位點也存在差異,但氨基酸序列沒有差異。以上差異可能由丹參品系差異造成。綜上所述，所有序列符合預期。對上述質粒進行測序鑒定，測序結果正確。

M.DL2000 marker；1. SmMYB33基因擴增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB33；2. SmMYB54基因擴增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB54；3. SmMYB93基因擴增產(chǎn)物 Amplification product of SmMYB93

圖1SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93基因的擴增
Fig.1AmplificationofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93

2.2 生物信息學分析

進化樹分析表明，SmMYB33聚到第2亞族，SmMYB54和SmMYB93聚到第4亞族，詳見圖2。

在丹參中經(jīng)過驗證的R2R3-MYBs用黑色圓點標注 R2R3-MYBs which was identified inSalviamiltiorrhizawere emphasized with black dots

圖2SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的進化樹
Fig.2PhylogenetictreeofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93

[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結構用紅色方框標出，DNEI二級結構用橙色方框標出，第2亞族特有二級結構IDxSFW-MxFWFD用綠色方框標出 The [D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R motif was emphasized with red box,the DNEI motif was emphasized with orange box,and the IDxSFW-MxFWFD motif specific to subgroup 2 was emphasized with green box

圖3SmMYB33的二級結構分析
Fig.3MotifanalysisofSmMYB33

[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結構用紅色方框標出，DNEI二級結構用橙色方框標出，第4亞族特有二級結構LxL[E/D]L用藍色方框標出 [D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R motif was emphasized with red box,the DNEI motif was emphasized with orange box,and the LxL[E/D]L motif specific to subgroup 4 was emphasized with blue box

圖4SmMYB54和SmMYB93的二級結構分析
Fig.4MotifanalysisofSmMYB54andSmMYB93

二級結構分析結果表明(圖3和圖4)，SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93含有R2R3型MYB轉錄因子特有的完整的R2和R3重復區(qū)域，并且每個重復區(qū)域含有1個螺旋—螺旋—轉折—螺旋的二級結構。R2和R3重復區(qū)域的一級結構(-W-(X19)-W-(X19)-W-……-F/I/L/M-(X18)-W-(X18)-W-)與之前報道相同[9]。二級結構分析表明，SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的R3重復區(qū)含有[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R二級結構，這個結構是負責與bHLH蛋白互作的區(qū)域[24-25]，表明這3個轉錄因子可能與某些bHLH轉錄因子存在互作；SmMYB33和SmMYB54含有DNEI結構[26]，這是一個與調節(jié)原花青素合成密切相關的保守二級結構[9]，表明這2個轉錄因子可能與原花青素合成密切相關；SmMYB33含有第2亞族特有的IDxSFW--MxFWFD結構[9]；SmMYB54含有第4亞族特有的LxL[E/D]L結構[9]。使用雙向BLAST法找到SmMYB33在擬南芥中的直系同源基因為 AtMYB15，沒有找到 SmMYB54和 SmMYB93在擬南芥中的直系同源基因。

2.3 亞細胞定位

如圖5，細胞核和細胞質均出現(xiàn)空載對照的綠色熒光；融合GFP的SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的綠色熒光在細胞核和細胞質中均可以被觀察到，在細胞核中綠色熒光十分明亮，而在細胞質中綠色熒光呈彌散狀態(tài)。

2.4 自激活活性分析

如圖6，轉化質粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB33、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93的酵母均能夠在含有不同濃度抑制劑的SD/-Trp+3AT培養(yǎng)基正常生長。在含有不同濃度抑制劑的SD/-Trp-His-Ade+3AT培養(yǎng)基上，轉化質粒pDEST-GBKT7、pDEST-GBKT7-SmMYB54和pDEST-GBKT7-SmMYB93的酵母均不能生長；轉化質粒pDEST-GBKT7-SmMYB33的酵母能夠生長，這表明 SmMYB33能夠在酵母中正確轉錄和翻譯，并能夠自己激活報告基因的轉錄和翻譯，但是隨著抑制劑3AT濃度的增加，酵母的生長受到明顯抑制。這表明SmMYB33有自激活活性，SmMYB54和SmMYB93沒有自激活活性。

1.明場 Bright field；2.綠色熒光蛋白的熒光場 Green fluorescent field of GFP；3.DAPI染料的熒光場 Blue fluorescent field of DAPI；4.擬合結果 Merged results

圖5SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93在洋蔥表皮細胞中的亞細胞定位結果
Fig.5SubcellularlocalizationofSmMYB33,SmMYB54andSmMYB93inonionepidermalcells

圖6 SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93的自激活活性分析Fig.6 Transactivation analysis of SmMYB33,SmMYB54 and SmMYB93

3 討 論

進化樹分析和二級結構分析表明SmMYB33、SmMYB54和SmMYB93是典型的R2R3-MYB類型的轉錄因子。轉錄因子的功能與結構密切相關[10]。進化樹結果表明SmMYB33聚到第2亞族，二級結構分析發(fā)現(xiàn)SmMYB33含有第2亞族特有的二級結構，使用雙向BLAST法得到 SmMYB33的直系同源基因為 AtMYB15，以上結果表明SmMYB33屬于R2R3-MYB轉錄因子第2亞族。在擬南芥中過表達 AtMYB15上調了莽草酸途徑中所有酶基因的表達，這暗示SmMYB33可能像AtMYB15一樣，能夠調控苯丙烷代謝通用途徑，影響丹參酚酸類物質的積累[27]。SmMYB54聚到第4亞族且含有第4亞族特有的二級結構，這表明SmMYB54屬于R2R3-MYB轉錄因子第4亞族。SmMYB93聚到第4亞族但不含有第4亞族特有的二級結構，不能確定 SmMYB93屬于哪個亞族。第4亞族的R2R3-MYB對苯丙烷代謝途徑常發(fā)揮抑制作用[10]，如在丹參毛狀根中過表達 SmMYB39顯著抑制酚酸類物質的積累[17]。SmMYB54屬于第4亞族，SmMYB93與第4亞族進化距離較近，這暗示這2個轉錄因子可能對苯丙烷代謝通用途徑有抑制作用，影響丹參酚酸類物質的積累。通過對轉錄因子進行結構分析，找到與它們進化距離較近的已知功能的轉錄因子，可以為其功能研究提供參考。

亞細胞定位結果表明，3個轉錄因子均可以定位在細胞核，暗示3個轉錄因子能夠調控細胞核中靶基因的轉錄過程。細胞質是許多生理過程發(fā)生的場所，3個轉錄因子也可能參與蛋白細胞質中的一些生理過程，比如質體中的轉錄過程。轉錄因子的功能或定位情況可能會受到其他轉錄因子的影響[19]。類似地，某些bHLH蛋白可能和上述3個轉錄因子協(xié)同互作，共同調控細胞質和細胞核中的生理過程，但還需要更多的試驗來驗證這些猜想。

SmMYB33有自激活活性，若想利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與SmMYB33互作的蛋白，需要找到并去除其轉錄自激活結構域，并確認其失去自激活活性。SmMYB54和SmMYB93沒有自激活活性，二者的載體可用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與其互作的蛋白。本研究中的自激活試驗為進一步探索3個轉錄因子的功能提供依據(jù)。

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