朱百濤，尹志遠(yuǎn)，吳玉星，高小寧，馮 浩，韓青梅，黃麗麗

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

蘋果樹腐爛病是由子囊菌黑腐皮殼屬真菌(Vaslamali)引起的蘋果樹枝干病害[1]。該病能引起蘋果樹主干、主枝皮層腐爛，乃至整株枯死，在中國各蘋果產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，嚴(yán)重影響蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-4]。根皮苷(Phlorizin)是根皮素的葡萄糖苷，在蘋果樹葉、枝和樹皮中廣泛存在，其中以樹皮中最高，達(dá)到64.32 mg/g[5]。在蘋果屬的樹皮中，抗腐爛病品種比感病品種具有相似或更高的根皮苷含量[6]。根皮苷對蘋果樹腐爛病菌與寄主互作起重要作用，蘋果樹腐爛病菌可以降解根皮苷產(chǎn)生5種有毒化合物，這些產(chǎn)物能產(chǎn)生與蘋果樹感染腐爛病同樣的樹皮壞死癥狀[7-8]。蘋果樹腐爛病菌降解根皮苷產(chǎn)生有毒化合物的能力與病菌致病力強(qiáng)弱相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株降解根皮苷產(chǎn)生更高含量的5種有毒化合物，弱致病力菌株只能產(chǎn)生低量的3～4種有毒化合物[9]。蘋果樹腐爛病菌及其代謝產(chǎn)物均能降解根皮苷，蘋果樹腐爛病菌代謝產(chǎn)生的蛋白類為降解根皮苷的主要成分，1 mg/L蛋白類對根皮苷作用1 d時，降解率達(dá)到75%，這些蛋白可能是酶類[10]。真核生物、古細(xì)菌和細(xì)菌糖苷類水解酶(GH)家族Ⅰ通常水解G-O-X(或G-S-X)型底物，其中G代表β連接的糖基，而X代表另一個糖基殘基，乳糖根皮苷降解酶(LPH)能降解根皮苷，屬于家族Ⅰ中的一種酶[11-15]。本研究基于蘋果樹腐爛病菌全基因組數(shù)據(jù)[2]，鑒定到對根皮苷具有降解作用的糖苷類水解酶(GH)家族Ⅰ的1個乳糖根皮苷水解酶(LPH)基因 Vmlph1，為明確該基因的功能，利用Double-joint PCR和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，對該基因進(jìn)行敲除，通過分析敲除突變體營養(yǎng)生長、致病力變化及對根皮苷降解的作用，明確該基因在蘋果樹腐爛病菌侵染過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料及儀器 蘋果樹腐爛病菌(V.mali)野生型分離株03-8由西北農(nóng)林科技大學(xué)果樹病害病原生物學(xué)及綜合防治研究團(tuán)隊分離并保存；蘋果‘富士’品種(MalusdomesticaBorkh. cv.‘Fuji’)枝條及葉片采于陜西省咸陽市楊凌區(qū)；質(zhì)粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS(含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hph)由浙江大學(xué)宋鳳鳴教授惠贈。 Waters 600E高效液相色譜儀；CFX96TMConnect Real-Time Systems(Bio-Rad)。

1.1.2 主要試劑 常用化學(xué)試劑(金華大)，根皮苷(春秋生物)，DH5α(天根)，Taq酶和內(nèi)切酶(Thermo)，膠回收提取試劑盒(百泰克)，質(zhì)粒小量提取試劑盒(Omega)，潮霉素B(Roche)，G418 (MP)，崩潰酶、溶壁酶(Sigma)，核酸提取試劑盒(華越洋)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，所用引物見表1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers in the study

1.2 試驗方法

1.2.1 基因敲除 以蘋果樹腐爛病菌野生型菌株03-8基因組DNA為模板，引物Vmlph1-1F/2R擴(kuò)增目的基因上游片段，Vmlph1-3F/4R擴(kuò)增目的基因下游片段，以質(zhì)粒 pHIG2RHPH2-GFP-GUS為模板hph-F/hph-R擴(kuò)增hph片段，膠回收各DNA片段。使用Double-joint PCR方法構(gòu)建基因敲除載體[16]。PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參照高靜等[17]的方法，100 μg/mL潮霉素篩選轉(zhuǎn)化子。對于能夠正常生長的菌株，提取DNA，用4對引物(Vmlph1-5F/6R、H850/H852、Vmlph1-1F/H855-R、H856-F/Vmlph1-4R)進(jìn)行PCR檢測[18]。CTAB法提取基因組DNA，內(nèi)切酶BgⅡ進(jìn)行酶切。電泳、轉(zhuǎn)膜，使用hph基因片段為探針進(jìn)行雜交，參照DIG DNA Labeling and Detection KitⅡ說明書。

1.2.2 表型觀察 活化野生型03-8及突變體菌株，用打孔器(d=5 mm)在菌落邊緣打取菌餅，挑取1個菌餅接到含有10 mL PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中央，每個菌株3個重復(fù)，25 ℃避光倒置培養(yǎng)，2 d后觀察菌落生長情況并測量菌落直徑，試驗重復(fù)3次。

1.2.3 突變體產(chǎn)孢變化觀察 挑取活化好的野生型03-8及突變體菌餅(d=5 mm)接到分別含有10 mL的PDA和ABA(蘋果樹皮煎汁培養(yǎng)基)平板中央，25 ℃避光倒置培養(yǎng)，7 d后置于光暗交替條件下(光照∶黑暗=12 h∶12 h)，25 ℃靜置培養(yǎng)，30 d后觀察各菌株產(chǎn)孢情況并計數(shù)。每個菌株設(shè)3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

1.2.4 致病力檢測 離體葉片致病力檢測參照韋潔玲等[19]的方法，葉片用φ=0.6%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒；針頭刺傷葉片正面；在傷口上接種野生型03-8及突變體菌餅，并以無菌PDA作為對照；置于托盤內(nèi)，25 ℃保濕培養(yǎng)3 d后測量病斑大小。離體枝條致病力檢測參照臧睿等[20]的方法，蘋果枝條用φ=0.6%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒；石蠟封頂，用電烙鐵對蘋果枝條進(jìn)行燙傷處理；在傷口上接種野生型03-8及突變體菌餅，并以無菌PDA作為對照； 置于托盤中，25 ℃保濕培養(yǎng)5 d后測量病斑大小。每個菌株設(shè)置3個重復(fù)，試驗重復(fù)3次。

1.2.5 根皮苷降解檢測 以根皮苷為碳源的病原菌發(fā)酵培養(yǎng)參照Okuno等[21]的方法，略有改動，MS培養(yǎng)基以0.1 g/L根皮苷為碳源。在100 mL滅菌PDB培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)中，加入10塊25 ℃黑暗培養(yǎng)2 d的03-8及突變體菌落邊緣菌餅(d=5 mm)，25 ℃ 100 r/min搖培2 d，除去PDB，用無菌水沖洗菌絲，換100 mL MS培養(yǎng)基，25 ℃ 100 r/min搖培24 h。

根皮苷的降解檢測參照王建華等[10]的方法，略有改動，取發(fā)酵液經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液，同時設(shè)置0.1 g/L根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照， HPLC法檢測根皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算各菌株對根皮苷的降解利用率，根皮苷降解率=(對照樣品中根皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)-處理樣品中根皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù))/對照樣品中根皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)×100%，試驗重復(fù)3次。

HPLC分析條件參照文獻(xiàn)[22]。

1.2.6 突變體黑色素合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化 以“1.2.5”方法培養(yǎng)和誘導(dǎo)野生型03-8和突變體菌株，過濾菌絲吸干水分，錫箔紙包裹菌絲迅速放入液氮中冷凍，-80 ℃冰箱保存，備用。以0 h菌株為對照，通過qRT-PCR檢測野生型03-8和突變體ΔVmlph1在誘導(dǎo)24 h時黑色素合成調(diào)控因子 Cmr1的表達(dá)量變化。華越洋核酸提取試劑盒提取野生型03-8和突變體菌絲樣品總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)合成第一鏈cDNA，4 μg RNA為模板，引物使用Oligo d(T)18。qRT-PCR：蘋果腐爛病菌 G6PDH作為內(nèi)參基因[23]， PCR體系參照GenStar 2×RealStar Green Power Mixture說明書進(jìn)行。目的基因相對表達(dá)量用2-△△Ct方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除突變體獲取

經(jīng)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)化子，以轉(zhuǎn)化子DNA為模板，利用4對引物進(jìn)行PCR檢測。對鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Southern Blot驗證，最終得到1個單拷貝敲除突變體ΔVmlph1-4(圖1)。

A：突變體4對引物PCR檢測 PCR detection of deletion mutant of four pairs of primers. 1.目的基因 Target gene; 2.hph基因hphcassette;3.上游片段 Upstream region;4.下游片段 Downstream region;M. DNA marker;B:突變體Southern blot檢測 Southern blot detection of the deletion mutant

圖1基因敲除突變體驗證
Fig.1Verificationofdeletionmutant

2.2 突變體表型觀察

突變體ΔVmlph1在PDA平板上生長2 d后，與野生型03-8相比，ΔVmlph1菌落變白、菌絲稀疏，生長速率減小(圖2)。表明Vmlph1基因影響菌落的形態(tài)和生長速率。

2.3 突變體產(chǎn)孢變化觀察

在光暗交替(光照∶黑暗=12 h∶12 h)條件下培養(yǎng)30 d后，PDA和ABA培養(yǎng)基上野生型03-8和突變體菌株都有分生孢子器生成。對分生孢子器進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與野生型03-8相比，突變體ΔVmlph1在PDA和ABA培養(yǎng)基上數(shù)量都顯著減少(圖3)。表明 Vmlph1影響蘋果腐爛病菌分生孢子產(chǎn)生。

2.4 突變體致病力檢測

與野生型03-8相比，突變體ΔVmlph1致病力顯著下降，在葉片上致病力下降22.0%，在枝條上致病力下降11.0%(圖4)。表明 Vmlph1基因影響病菌致病力。

*表示顯著性差異(P<0.05)，下同 * indicates significant difference(P<0.05)，the same below.

圖3 野生型菌株03-8和突變體在PDA和ABA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢情況Fig.3 Pycnidia formation of wild type strain 03-8 and mutant inoculated on PDA and ABA mediums respectively

2.5 根皮苷降解檢測

HPLC檢測結(jié)果顯示，野生型03-8對發(fā)酵液中根皮苷降解率為26.7%，ΔVmlph1降解率25.4%，表明突變體ΔVmlph1與野生型03-8對根皮苷的降解能力無顯著差異。

2.6 突變體黑色素基因簇表達(dá)量變化

qRT-PCR結(jié)果(圖5)顯示根皮苷誘導(dǎo)24 h后，野生菌株03-8和突變體黑色素合成調(diào)控基因 Cmr1相對表達(dá)量分別為未誘導(dǎo)菌株的3.7、1.9倍，突變體ΔVmlph1中 Cmr1的上調(diào)倍數(shù)顯著低于野生型03-8，表明 Vmlph1基因的敲除影響病菌 Cmr1基因的表達(dá)，該基因可能與病菌黑色素合成有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究首次對蘋果樹腐爛病根皮苷水解酶基因 Vmlph1進(jìn)行研究，利用基因敲除技術(shù)及PEG介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得目的基因的敲除突變體，與野生型03-8相比，該基因敲除突變體ΔVmlph1菌落顏色變白，生長速率和分生孢子產(chǎn)量顯著降低，在蘋果葉片和枝條上致病力顯著降低。表明 Vmlph1基因與蘋果樹腐爛病菌的侵染和致病相關(guān)。

蘋果樹腐爛病菌分解小部分根皮苷產(chǎn)生根皮酸，根皮酸再次被分解為致病毒素，致使蘋果樹皮層腐爛，病菌迅速擴(kuò)張[24]。在活體試驗中，蘋果樹腐爛病菌的致病力高度依賴與其分解根皮苷產(chǎn)生有毒化合物的能力，弱致病力菌株比強(qiáng)致病力菌株產(chǎn)生更少量的有毒化合物[9]。本研究結(jié)果顯示，與野生型03-8相比，突變體ΔVmlph1致病力顯著降低，但其對根皮苷降解能力無顯著性變化。表明 Vmlph1基因的敲除對病菌降解根皮苷的能力無影響。病菌可能存在其他糖苷水解酶基因的共同作用，實現(xiàn)對根皮苷的降解利用。

圖4 突變體在蘋果葉片和枝條上的致病力檢測Fig.4 Pathogenicity test and analysis of mutant on apple leaves and twigs

圖5 野生型03-8及突變體在根皮苷誘導(dǎo)下 Cmr1基因相對表達(dá)量 Fig.5 Relative expression of Cmr1 in wild type strain 03-8 and mutant induced by phlorizin

根皮苷通過cAMP信號傳導(dǎo)途徑增加酪氨酸酶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)L-DOPA黑色素的生成[25]。在煙曲霉(Aspergillusfumigatu)中，DHN黑色素合成關(guān)鍵基因pksP的表達(dá)部分地由cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑控制，而 Cmr1基因調(diào)控黑色素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄[26-28]。突變體ΔVmlph1在PDA培養(yǎng)基上菌落顏色變白，在根皮苷誘導(dǎo)下，野生型 Cmr1基因表達(dá)量比突變體ΔVmlph1顯著上調(diào)。此結(jié)果表明 Vmlph1基因的缺失導(dǎo)致 Cmr1基因表達(dá)量下降從而影響病菌黑色素的合成。

本研究初步探究 Vmlph1基因的功能，然而蘋果樹腐爛病降解根皮苷是一個復(fù)雜的過程，亟待進(jìn)一步研究。

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