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      膠原誘導類風濕關節(jié)炎小鼠的重要臟器病理變化*

      2018-05-10 06:25:59郭晴晴趙雨坤邱雪梅樊丹平呂愛平何小鵑
      關鍵詞:病理變化類風濕膠原

      郭晴晴,鄭 康,趙雨坤,劉 學,邱雪梅,樊丹平,呂愛平,何小鵑**

      (1.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所 北京 100700;2.西南交通大學生命科學與工程學院 成都 610031;3.香港浸會大學中醫(yī)藥學院 香港 999077)

      類風濕關節(jié)炎是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫疾病,特征為多關節(jié)、對稱性、侵襲性關節(jié)炎癥,多發(fā)于手、足小關節(jié),常伴有關節(jié)外器官受累[1,2]。類風濕關節(jié)炎病人關節(jié)的主要病理特征表現(xiàn)為滑膜增生、關節(jié)腔變小、炎細胞浸潤、血管翳形成、關節(jié)軟骨及軟骨下骨的破壞等[3,4]。除了關節(jié)的病理變化,還會出現(xiàn)多種關節(jié)外病變,例如心臟病變、肺部病變、腎臟損害等[5]。類風濕關節(jié)炎的關節(jié)病變一般只能致殘,致死罕見,但是關節(jié)外的損害有致死的可能。因此,全面了解類風濕關節(jié)炎的關節(jié)外表現(xiàn)有利于我們對類風濕關節(jié)炎全貌的認識,有利于避免誤診,早期治療,改善預后。

      多種類風濕關節(jié)炎動物模型的建立促進了我們對類風濕關節(jié)炎發(fā)病機制及病理變化的研究和認識,特別是對關節(jié)病理的研究,但是利用動物模型研究類風濕關節(jié)炎關節(jié)外病變的較少。小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型在臨床表現(xiàn)和病理機制等方面與人的類風濕關節(jié)炎有很多相似之處,是研究類風濕關節(jié)炎病理機制的較理想模型[6]。因此,我們采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠,觀察小鼠各個重要臟器的病理變化,以期觀察該模型是否可用于類風濕關節(jié)炎關節(jié)外病變的研究。

      1 實驗材料

      1.1 實驗動物

      20只DBA/1小鼠,雄性,7-8周,18-22 g,SPF級,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2012-0001,在恒溫(24±2)℃、光照周期12 h環(huán)境中飼養(yǎng)。

      1.2 主要試劑及儀器

      主要試劑:完全弗氏佐劑(Chondrex,Lot:150034)、牛II型膠原(Chondrex,Lot∶140519)、Mayer蘇木素染色液(LEAGENE,Lot∶0911A15)、伊紅染色液(LEAGENE,Lot∶0810A15)、UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物工程股份有限公司,Lot∶CA04KA4108)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara,Lot∶AK3401)、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(Takara,Lot∶AK7103)。

      主要儀器:小型高速離心機(eppendorf,型號:Cen?trifuge 5430)、渦旋振蕩儀(其林貝爾儀器制造有限公司,型號:QL-902)、熒光定量PCR儀(Applied Biosys?tems,型號:ABI7500)、包埋機(Thermo Scientific,型號:Shandon Histocentre 3)、切片機(Thermo Scientific,型號:Shandon Finesse ME+)、展片機(Thermo Scientific,型號:Tissue Flotation Bath)、烤片機(Thermo Scientific,型號:Hotplate)、正置生物顯微鏡(LEICA,型號:DM6000B)、微量紫外分光光度計(Thermo Scientific,型號:Nanodrop 2000)。

      1.3 引物合成及序列

      TGF-β1、TNF-α及內參基因GAPDH的上下游引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成。TGF-β1 上游引物:5′-ATTGGCCAGCATCCATCTCTTG-3′,下游引物:5′-TGCCACCATCATAGACTAG?ATTC-3′;TNF-α上游引物:5′-AGGCACTCCCCCAA AAGAT-3′,下游引物:5′-CAGTAGACAGAAGAGCGT?GGTG-3′;GAPDH上游引物:5′-AGGCCGGTGCTGAG?TATGTC-3′,下游引物:5′-TGCCTGCTTCACCACCTT CT-3′。

      2 實驗方法

      2.1 小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型的制備

      將DBA/1小鼠隨機分成2組,分別為正常對照組和模型組,每組10只。模型組小鼠按以下方法造模:濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原溶液和完全弗氏佐劑以1∶1(體積比)的比例混合,將牛Ⅱ型膠原逐滴加入完全弗氏佐劑中,整個過程在冰浴中進行,邊滴邊用勻漿器乳化,每轉3 min,停止1 min,直至將乳化劑滴至水中,若不擴散說明已充分乳化。乳化劑需現(xiàn)用現(xiàn)配,Day 0于尾根部皮內注射,100 μL/只,Day 21用同樣的方法加強免疫[7]。

      2.2 關節(jié)炎評分

      造模后每周進行一次關節(jié)炎評分,評分標準如下:0分=無紅腫;1分=小趾關節(jié)紅腫;2分=趾關節(jié)和小趾關節(jié)腫脹;3分=踝關節(jié)以下部位腫脹;4分=整個足爪腫脹(包含踝關節(jié))。每次記錄小鼠四肢的評分,累計最高評分為16分[8]。

      2.3 病理學觀察

      于Day63處死小鼠,分離心、肝、脾、肺、腎和踝關節(jié)。將臟器置于10%福爾馬林緩沖液中固定,將踝關節(jié)剔除周圍軟組織后置于4%多聚甲醛中固定。踝關節(jié)固定48 h后,置于10%EDTA脫鈣液中脫鈣,以1 mL注射器針頭能刺入關節(jié)骨內為脫鈣完全。將脫鈣好的踝關節(jié)用不同濃度的梯度乙醇脫水,二甲苯中透明,石蠟包埋,制作病理切片(4 μm),經蘇木素-伊紅(HE)染色后,顯微鏡下觀察各組織病理學變化。

      2.4 Real-time PCR檢測小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平

      按照UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒的說明書提取小鼠肺總RNA,使用Nanodrop 2000測量RNA的純度和濃度。按照Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒中的說明書將RNA反轉錄成cDNA。Real-time PCR按照SYBR?Premix Ex Taq?II(Tli RNase H Plus)試劑盒中的說明書進行操作,擴增程序為:95℃ 30 sec,(95℃ 5 sec,60℃ 40 sec)×45個循環(huán),95℃15 sec,60℃1 min,95℃15 sec。采用2-△△CT法計算目的基因mRNA的相對表達量。

      3 結果

      3.1 CIA小鼠體征觀察情況

      DBA/1小鼠造模成功后,毛發(fā)逐漸失去光澤,前肢、后肢陸續(xù)出現(xiàn)紅腫現(xiàn)象,功能障礙,活動減少,體重下降,Day42-63為腫脹高峰期,發(fā)病率達100%。圖1為正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關節(jié)比較圖。

      3.2 CIA小鼠關節(jié)炎評分結果

      CIA小鼠的關節(jié)炎評分見圖2,分析可知,小鼠于Day28左右開始發(fā)病,然后關節(jié)炎評分逐漸增高,Day42-63為疾病高峰期,最高評分可達12分。

      3.3 CIA小鼠踝關節(jié)和心、肝、脾、肺、腎的組織病理變化

      3.3.1 踝關節(jié)病理表現(xiàn)

      圖1 正常小鼠和CIA發(fā)病小鼠的關節(jié)比較圖

      圖2 CIA小鼠關節(jié)炎評分

      正常小鼠和CIA小鼠的踝關節(jié)HE染色病理圖見圖3,結果顯示:正常小鼠的踝關節(jié)結構完整,關節(jié)腔內干凈,關節(jié)表面光滑平整,滑膜細胞1-2層,排列整齊,軟骨和骨非常完整。CIA小鼠的踝關節(jié)可見滑膜增生,關節(jié)間隙明顯變窄,有關節(jié)腔積液,大量的炎細胞浸潤,血管翳形成,軟骨和軟骨下骨均有侵蝕現(xiàn)象。

      3.3.2 心臟病理學表現(xiàn)

      正常小鼠和CIA小鼠的心臟HE染色病理圖見圖4,結果顯示:正常小鼠的心肌組織結構清晰,心肌纖維細長,呈圓柱形,心肌纖維間有少量的結締組織。CIA小鼠的心臟病理結果和正常小鼠的相似,沒有出現(xiàn)明顯的病理變化。

      3.3.3 肝臟病理學表現(xiàn)

      正常小鼠和CIA小鼠的肝臟HE染色病理圖見圖5,結果顯示:正常小鼠的肝小葉結構清晰完整,肝細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列,形態(tài)結構正常。CIA小鼠的肝臟未出現(xiàn)異?,F(xiàn)象。

      3.3.4 脾臟病理學表現(xiàn)

      正常小鼠和CIA小鼠的脾臟HE染色病理圖見圖6,結果表明:正常小鼠的脾臟結構特征清晰完整,白髓和紅髓的界限比較明顯,能清楚的看到淋巴小結中央動脈以及動脈周圍的淋巴鞘,淋巴細胞密集。CIA小鼠的脾臟沒有發(fā)現(xiàn)明顯的病理變化。

      3.3.5 肺臟病理學表現(xiàn)

      正常小鼠和CIA小鼠的肺臟HE染色病理圖見圖7,結果顯示:正常小鼠的肺組織中肺泡的結構完整清晰,肺泡腔和支氣管腔非常干凈,有少量的紅細胞。CIA小鼠的肺部有大量的炎性細胞浸潤,肺泡間隔增厚,肺泡腔中有炎性浸出物,部分肺泡變小。

      圖3 小鼠踝關節(jié)的HE染色圖(×200)

      圖4 小鼠心臟的HE染色圖(×200)

      圖5 小鼠肝臟的HE染色圖(×400)

      圖6 小鼠脾臟的HE染色圖(×400)

      圖7 小鼠肺臟的HE染色圖(×200)

      3.3.6 腎臟病理學表現(xiàn)

      圖8 小鼠腎臟的HE染色圖(×400)

      圖9 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

      正常小鼠和CIA小鼠的腎臟HE染色病理圖見圖8,結果顯示:正常小鼠的腎臟結構正常,有皮質和髓質之分,可見大量的泌尿小管,以及由少量結締組織、血管、神經等構成的腎間質,腎小管上皮細胞完好。CIA小鼠的腎臟未見明顯的病理變化。

      3.4 小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA表達水平

      由圖9可知,模型組小鼠肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平明顯高于正常組小鼠的肺組織(P<0.01)。

      4 討論

      類風濕關節(jié)炎作為以滑膜炎和關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的全身性疾病,經常伴有一些關節(jié)外損害[9]。本文采用牛II型膠原混合完全弗氏佐劑誘導DBA/1小鼠,成功建立了小鼠CIA模型,并觀察小鼠各個重要臟器的病理變化,以期觀察該模型是否存在關節(jié)外的并發(fā)癥。研究發(fā)現(xiàn),造模成功的DBA/1小鼠除肺部有明顯病變外,肝、心、脾、腎未出現(xiàn)明顯的病理變化。

      據臨床觀察及文獻報道,肺臟是RA患者除關節(jié)外最易受累的器官,這與肺內部豐富的結締組織及血液供應有很大關系。RA的肺部并發(fā)癥包括肺間質病變、細支氣管炎、慢性支氣管擴張、胸腔積液、類風濕結節(jié)等[1]。RA并發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病在RA患者死因中位居第二位,且近年來其死亡率呈明顯上升趨勢,其中由于類風濕關節(jié)炎間質性肺?。≧A-ILD)引起的肺泡炎性肺纖維化是其死亡的直接或間接原因[10]。RA-ILD的高死亡率是由于肺部病變早期癥狀不明顯易被忽略,晚期出現(xiàn)癥狀后預后差[11]。因此早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療RA合并肺部并發(fā)癥有重要意義。

      間質性肺病早期肺實質細胞發(fā)生急性肺泡炎,炎癥和免疫效應細胞不斷增生、募集與活化,隨著病情發(fā)展,肺泡結構破壞,間質膠原紊亂,大量纖維組織增生,肺泡隔被破壞,形成囊性化,病變不可逆[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)CIA小鼠的肺部出現(xiàn)明顯的炎性病變,肺間質內有大量的炎細胞浸潤,肺泡間隔增厚,肺泡腔中有炎性浸出物,這與RA肺部并發(fā)癥的病理變化有相似之處。

      RA-ILD的發(fā)病機制可能與細胞、細胞因子以及細胞外基質等因素的相互作用有關,過程復雜,仍有待進一步闡明[13]。據報道,肺富含TGF-β,誘導TGF-β活性高表達是肺間質纖維化進程啟動的重要因素之一[14,15]。此外,TNF-α等細胞因子可刺激肺內皮細胞和白細胞釋放炎性介質,進而損傷肺組織,形成肺間質纖維化[16,17]。本研究采用Real-time PCR法分別檢測病變的CIA小鼠肺組織和正常的肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)病變肺組織中TGF-β1和TNF-α的mRNA水平顯著高于正常肺組織。

      綜上所述,膠原誘導的DBA/1小鼠的肺部病變與RA肺部并發(fā)癥的病理變化及發(fā)病機制有相似之處,可以利用該模型進行RA肺部受累的研究,有利于通過動物模型進行深入的機制研究和藥效研究。

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