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      峨眉山區(qū)??扑幱弥参颕TS2條形碼序列鑒定*

      2018-05-10 06:26:01任瑤瑤謝博文江南屏劉睿穎
      關(guān)鍵詞:種間峨眉山藥用植物

      任瑤瑤,張 良,謝博文,江南屏,劉睿穎,譚 睿

      (西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031)

      峨眉山位于四川盆地邊緣亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū),峨眉山最高海拔為3 099 m,山頂山麓相對高差近2 600 m,氣候懸殊,山頂和山麓溫差大,氣溫垂直變化顯著,因而其植被分布具有明顯的垂直分布性,加之峨眉山區(qū)降雨量豐富,空氣相對濕度達(dá)80%以上,使得該區(qū)域植物資源極為豐富,多種自然要素的交匯,形成了峨眉山豐富的植物種類和復(fù)雜的區(qū)系成分[1,2]。

      ??疲∕oraceae)植物約有53屬1 400種,多產(chǎn)于熱帶、亞熱帶,少數(shù)分布在溫帶地區(qū)。我國約有12屬153種和亞種,并有變種及變型59個[3]。??浦参镏芯哂兴幱脙r值的??浦参锛s55種,在我國國民經(jīng)濟(jì)中具有重大意義[4]。構(gòu)屬(Broussonetia)藥用植物具有增強(qiáng)免疫[5]、消除自由基[6]、降血脂等作用[7];桑屬(Morus)植物降血糖作用[8]、降壓降血脂作用、抗氧化作用[9]抗菌和抗病原微生物作用[10];榕屬(Ficus Linn)植物有降血糖[11]、鎮(zhèn)痛抗炎[12]、抗菌[13,14]、增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的作用。峨眉山有豐富的??扑幱觅Y源,??浦性S多的用植物具有藥食兩用價值,峨眉山常見的??扑幱弥参镉猩#∕orus alba)、地果(Ficus tikoua)、黃葛樹(Ficus virens)、冠毛榕(Ficus gasparriniana)、異葉榕(Ficus heteromorpha)、葎草(Humulus scandens)、小構(gòu)樹(Broussonetia kazinoki)、構(gòu)樹(Broussonetia papyrifera)等,且分布廣泛,資源較為豐富。

      運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)對藥用植物進(jìn)行鑒定是現(xiàn)在中藥鑒定研究的熱點[15]。陳士林等[16]首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列。本實驗采集了峨眉山區(qū)不同地區(qū)的??浦参飿颖荆腉enbank下載同科或同屬ITS2序列,以ITS2序列作為DNA條形碼,對所有序列進(jìn)行遺傳距離、barcoding gap、Neighbor Joining(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹和ITS2序列二級結(jié)構(gòu)分析,對桑科藥用植物進(jìn)行鑒定。通過DNA條形碼技術(shù)對??浦参锏姆诸愡M(jìn)行研究,對具有藥用價值的桑科植物的研究提供基礎(chǔ),同時也為進(jìn)一步對峨眉山藥用植物資源的分布環(huán)境、種群量、種群動態(tài)等方面的調(diào)查分析奠定基礎(chǔ)。

      表1 桑科植物樣本信息

      1 材料

      從四川省峨眉山區(qū)采集了25份??浦参飿颖?,經(jīng)西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院宋良科副教授鑒定,其中桑樣品6份、地果樣品3份、冠毛榕樣品4份、異葉榕4份樣品、葎草樣品2份、小構(gòu)樹樣品3份、構(gòu)樹樣品3份樣品信息見表1。標(biāo)本保存于西南交通大學(xué)標(biāo)本室。同時在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載??浦参颕TS2序列23條,見表2。

      2 方法

      2.1 樣品DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

      參照任瑤瑤等[18]文章中樣品DNA提取、測序等方法,對所采集的樣本進(jìn)行基因組DNA提取、ITS2片段PCR擴(kuò)增及測序。

      表2 GenBank下載??浦参颕TS2序列

      2.2 數(shù)據(jù)處理

      圖1 桑科植物樣本種間和種內(nèi)距離

      圖2 ??扑幱弥参飿颖綢TS2序列種內(nèi)和種間變異分布

      采用CodonCode Aligner 6.0.2軟件對所得序列峰圖進(jìn)行校對拼接,去除引物區(qū)和低質(zhì)量的序列,由基于隱馬爾可夫模型(HMMer)的注釋方法切除ITS2兩端的5.8 S和28 S區(qū)域,獲得標(biāo)準(zhǔn)的ITS2間隔區(qū)序列[19]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比對[20]進(jìn)行種內(nèi)、種間的遺傳變異分析[21]、計算K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離、相鄰結(jié)合法(Neighbor Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22],利用Booststrap(1000重復(fù))檢驗各分支的支持率。利用TAXON DNA 1.8和DNAMAN 8.0軟件對所有樣本種內(nèi)、種間遺傳距離進(jìn)行分布頻度及樣本序列的變異程度進(jìn)行分析,評價Barcoding gap。根據(jù)Koetschan等[23]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(http://its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de)預(yù)測不同種屬樣本ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)。

      3 結(jié)果

      3.1 變異位點及種內(nèi)、種間K2P遺傳距離分析

      所有ITS2序列長度為234-254 bp、GC含量58%-72%(見表1)。應(yīng)用MEGA6.0軟件對所有樣品及下載序列進(jìn)行多序列比對,全序列排序比對后序列長度為274 bp,種內(nèi)變異位點少,種間變異位點多,其中變異位點有185個,簡約性信息位點166個,分別占總序列長度的67.52%和60.58%。

      物種間種內(nèi)距離越小、種間距離越大越適合條形碼鑒定[18]。參照陳士林等方法[16],應(yīng)用MEGA 6.0軟件基于K2P距離模型計算樣本種內(nèi)、種間變異距離值,結(jié)果見圖1。DNAMAN軟件對比序列發(fā)現(xiàn):M.mongolica與M.alba種類序列相似度為100%,種間序列相似度為99.89%,兩者種間遺傳變異較??;而F.tikoua種內(nèi)序列相似度為99.50%,其種內(nèi)變異程度(K2P 0.012)大于M.mongolica與M.alba種間變異程度(K2P 0.005)。此外所有樣本種內(nèi)最大變異值為0.0049,所有樣本種間最小遺傳距離為0.041;由熱圖可見本實驗中??茦悠贩N內(nèi)、屬內(nèi)顏色淺,其K2P遺傳距離較?。桓鲗僦g遺傳距離較大,為圖中顏色較深區(qū)域;葎草屬與其他屬樣本種間遺傳變異值較大,在熱圖中所對應(yīng)的區(qū)域顏色最深。分析統(tǒng)計樣本種內(nèi)和種間遺傳距離分布(圖2)發(fā)現(xiàn):樣本間存在較為明顯的barcoding gap,說明ITS 2序列對??茦颖驹诜N水平上鑒定能力較強(qiáng);種間變異距離值主要集中在0.300-0.600區(qū)間,主要是構(gòu)屬、葎草屬、榕屬之間的遺傳變異距離值組成。

      3.2 NJ樹分析

      利用MEGA 6.0軟件根據(jù)Kimura 2-parameter model對所有ITS2序列樣本構(gòu)建Neighbor-joining(NJ)系統(tǒng)聚類樹(圖3),從NJ進(jìn)化樹圖可以看出,各樣本屬內(nèi)各單據(jù)一支,分別為榕屬、桑屬、構(gòu)屬、葎草屬,分支之間靴帶檢驗法(bootstrap)支持率在90%以上;各屬內(nèi)種內(nèi)之間又各聚為小枝,支持率在85%以上;由NJ進(jìn)化樹可見,ITS2序列能將??茦颖驹诜N水平上很好地分開,鑒定成功率為100%。

      3.3 ITS2二級結(jié)構(gòu)的分析

      ??浦参飿颖綢TS2序列的二級結(jié)構(gòu)如圖4所示,從樣本的二級結(jié)構(gòu)中可以看出,ITS2二級結(jié)構(gòu)相互之間均有差異,其均為一個中心環(huán)及4個螺旋區(qū)(Helix)組成,中心環(huán)大小、形狀形成差異,在螺旋區(qū)莖環(huán)(Loop)數(shù)量、形狀及大小形成差異,四個螺旋區(qū)的夾角也有明顯差異。F.pumila、H.scandens、M.alba、B.papyrifera的中心環(huán)為異形,四者二級結(jié)構(gòu)主要差異在于Ⅱ螺旋區(qū)莖環(huán)的大小數(shù)量差異。因此通過ITS2二級結(jié)構(gòu)可將桑科樣本中各個種較為直觀地鑒別開來。

      圖3 基于ITS序列構(gòu)建的??浦参飿颖镜腘J樹

      4 結(jié)論

      DNA條形碼技術(shù)旨在建立一種準(zhǔn)確、方便、快捷且對技術(shù)要求不高的一種生物分類鑒定方法,ITS2序列對植物具有良好的擴(kuò)增成功率和物種水平的鑒定成功率[24,25],以ITS2序列作為DNA條形碼對桑科植物的鑒定進(jìn)行研究可以達(dá)到即快速又準(zhǔn)確。本研究將峨眉山區(qū)不同地方的25份桑科植物樣本的ITS2序列分析,桑科樣本ITS2序列變異位點和簡約性信息位點在全序列中占比67.52%和60.58%,說明ITS2序列中存在大量的物種分類及進(jìn)化信息,在對K2P遺傳距離分析通過桑科植物樣本種間和種內(nèi)距離的熱圖可以看出種內(nèi)顏色較淺、屬內(nèi)顏色次之,種內(nèi)和種間變異分布有明顯的barcoding gap,NJ樹可以看出??撇煌瑢儆H緣關(guān)系較遠(yuǎn)各聚一大支,而同屬之間親緣關(guān)系比較近,但是不同種也很明顯的各聚一小支。綜合所有樣本ITS2序列種內(nèi)、種間的變異距離值、barcoding gap分析、NJ樹構(gòu)建及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測等多種方法從不同方面對考察了ITS2條形碼序列對??浦参镨b定能力,結(jié)果均表明,以ITS2序列為DNA條形碼對桑科藥用植物種水平上的鑒定能力強(qiáng)。

      圖4 ??艻TS2序列的二級結(jié)構(gòu)

      峨眉山資源植物品類齊全,尤其是在藥用、食用等方面的植物資源最為豐富多樣,是我國資源植物的重要野外基因庫,為當(dāng)?shù)氐纳鐣c經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了獨特的、重要的支撐[26]。利用DNA條形碼技術(shù),對資源植物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定,對峨眉山地區(qū)藥用植物資源進(jìn)行廣泛地調(diào)查和分析,并對其進(jìn)行認(rèn)識、保護(hù)和合理開發(fā)利用。藥用植物資源的鑒定工作固然重要,但資源管理也相當(dāng)重要,將二維DNA條形碼應(yīng)用于中藥材鑒定,對中藥材流通的數(shù)字化監(jiān)管[27]的思路可借鑒到對藥用資源的調(diào)查中,結(jié)合分布環(huán)境,弄清種群量和種群動態(tài)等問題,正確的評價資源植物當(dāng)前的狀況,在此基礎(chǔ)上制訂出切合實際的保護(hù)及合理開發(fā)利用的措施。

      1 胡霞,曾沙.峨眉山不同植被類型冬季大型土壤動物群落結(jié)構(gòu).重慶師范大學(xué)學(xué)報,2017,34(2):96-101.

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