胡珊珊， 張明生，呂 享，李小蘭，李 歡

(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/國(guó)家喀斯特石漠化防治工程技術(shù)研究中心， 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit.].為天南星科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)重要中藥材之一，具有燥熱化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)等功效[1]。近年來，由于人們對(duì)野生半夏的掠奪性采挖，導(dǎo)致其自然資源急劇減少，人工種植是半夏產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必由之路，但長(zhǎng)期采用塊莖繁殖導(dǎo)致病害嚴(yán)重、種質(zhì)退化、產(chǎn)量下降[2-6]等一系列問題。半夏人工種子技術(shù)已成為近年來的研究熱點(diǎn)[7-9]，但半夏人工種子生產(chǎn)中同步化的人工種胚至今仍難獲得，其根本原因在于半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)困難，嚴(yán)重限制半夏人工種子的產(chǎn)業(yè)化。疏松愈傷組織增殖快，通過懸浮培養(yǎng)，可獲得大量均一分散的同步化人工種胚。致密愈傷組織細(xì)胞連接緊實(shí)而不易分散，不適于作懸浮培養(yǎng)材料。果膠為細(xì)胞壁胞間層主要成分，其作用有助于將相鄰細(xì)胞粘連在一起。纖維素存在于細(xì)胞壁的初生壁和次生壁中，可使細(xì)胞維持一定形狀和延展性。程杰山等[10]研究了不同硬度的辣椒品質(zhì)在果實(shí)發(fā)育中果膠、纖維素等的含量變化，發(fā)現(xiàn)果膠和纖維素含量變化對(duì)不同品系辣椒硬度可能有較大影響。所以，本研究通過對(duì)半夏疏松愈傷組織和致密愈傷組織進(jìn)行石蠟切片顯微觀察其結(jié)構(gòu)，并分析愈傷組織果膠、纖維素和半纖維素含量，比較研究?jī)煞N愈傷結(jié)構(gòu)和細(xì)胞壁成分差異，以期為進(jìn)一步研究疏松愈傷組織形成機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit.]由貴州省赫章縣半夏藥材基地提供。

1.2 方法

愈傷組織的誘導(dǎo)：選擇生長(zhǎng)15 d的半夏無菌苗，切取葉柄(0.5 cm)作為外植體備用。以MS為基本培養(yǎng)基，加入蔗糖30 g/L，瓊脂6.0 g/L，并添加不同質(zhì)量濃度的2，4-D和6-BA。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基pH 5.8，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12 h/d。愈傷組織誘導(dǎo)率 = 形成愈傷組織的半夏葉柄數(shù)/接入半夏葉柄總數(shù)100%。

愈傷組織結(jié)構(gòu)觀察及果膠定位：采用常規(guī)石蠟切片法[11]，選取誘導(dǎo)出的最疏松和致密的愈傷組織后，用50%福爾馬林-乙酸-酒精(FAA)固定液固定，經(jīng)過酒精梯度脫水、透明、石蠟包埋、番紅/釕紅-固綠雙重染色、中性樹膠封片等過程，制成永久切片，顯微鏡觀察并拍照。果膠定位與常規(guī)石蠟切片法過程相同，番紅染色替換為釕紅染色20～30 min即可。

愈傷組織果膠、纖維素和半纖維素的測(cè)定：果膠含量采用咔唑-濃硫酸法測(cè)定[12]，纖維素含量采用蒽酮比色分光光度法測(cè)定[13]，半纖維素含量采用2 mol/L鹽酸水解法測(cè)定[14]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-D與6-BA組合對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同濃度2，4-D與6-BA組合對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)率影響的差異不大，但對(duì)其質(zhì)地有顯著影響(表1和圖1)。外植體接種10 d后，開始出現(xiàn)灰白色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察到處理4的愈傷組織增殖快，質(zhì)地較疏松，呈淡黃色(圖1 A)。將其培養(yǎng)28～30 d后轉(zhuǎn)到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以28～30 d繼代一次，繼代2～3次可獲得顏色淡黃、結(jié)構(gòu)疏松的愈傷組織，該疏松愈傷組織即可通過懸浮培養(yǎng)以獲得同步化人工種胚用于半夏人工種子制作。其它處理的愈傷組織的質(zhì)地均不如處理4的疏松，不適宜用作懸浮培養(yǎng)獲得疏松愈傷組織。處理9的愈傷組織增殖慢，質(zhì)地緊實(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)其顏色逐漸變黃加深，并出現(xiàn)分化現(xiàn)象(圖1 B)。

表1 2，4-D與6-BA組合對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effects of 2,4-D and 6-BA concentration on callus induction

圖1 接種10 d后的半夏愈傷組織Fig.1 Callus of P. ternata 10 days after inoculating

2.2 半夏兩種愈傷組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞壁成分差異

與致密愈傷組織(圖2 A)相比，半夏疏松愈傷組織的結(jié)構(gòu)較松散，細(xì)胞及胞間間隙較大，細(xì)胞壁較薄(圖2 B)。

致密愈傷組織的化學(xué)成分定位顯示，其細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙中同時(shí)存在著色為綠色的纖維素部分及著色為紫色的果膠和纖維素的混合部分(圖2 C)，綠色較深，說明其細(xì)胞壁纖維素含量較高；而紫色部分較淺，說明其果膠含量較低，即中膠層中細(xì)胞粘結(jié)物果膠質(zhì)很少水解成果膠，細(xì)胞間連接緊密。疏松愈傷組織的化學(xué)成分定位顯示出細(xì)胞壁及細(xì)胞間隙幾乎僅存在著色為紫色的果膠與纖維素的混合部分(圖2 D)，顏色較深，說明其果膠含量較高，即中膠層中細(xì)胞粘結(jié)物果膠質(zhì)大量水解成果膠，細(xì)胞間連接被解除，使其愈傷組織細(xì)胞松散；而綠色極少，說明其細(xì)胞壁纖維素合成較少，含量甚微，使細(xì)胞壁剛性減弱，細(xì)胞生長(zhǎng)加快。

A： 致密愈傷組織番紅-固綠染色切片; B： 疏松愈傷組織番紅-固綠染色切片; C： 致密愈傷組織釕紅-固綠染色果膠定位切片; D： 疏松愈傷組織釕紅-固綠染色果膠定位切片

化學(xué)成分含量分析結(jié)果表明，半夏愈傷組織形成過程中，疏松愈傷組織的果膠含量顯著高于致密愈傷組織，是致密愈傷組織的1.2～2.9倍(P0.05)，培養(yǎng)28 d后急劇增加，而致密愈傷組織的果膠含量則一直下降(圖3)。致密愈傷組織的纖維素含量顯著高于疏松愈傷組織，是疏松愈傷組織的1.9～2.9倍(P0.05)，且一直呈上升趨勢(shì)，而疏松愈傷組織則有增有減，變幅較小，培養(yǎng)28 d后一直呈下降趨勢(shì)(圖4)。

圖3 半夏愈傷組織形成過程中果膠含量變化Fig.3 Veriation of pectin contents during callus formation of P. ternata

圖4 半夏愈傷組織形成過程中纖維素含量變化Fig.4 Changes of cellulose contents during callus formation of P. ternata

化學(xué)成分含量分析結(jié)果與化學(xué)成分定位結(jié)果有高度的一致性。該研究結(jié)果暗示，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)(如2，4-D和6-BA)對(duì)半夏愈傷組織形成的類型起著決定性作用，若要獲得適于懸浮培養(yǎng)的疏松愈傷組織，則須通過對(duì)培養(yǎng)條件的調(diào)節(jié)(如調(diào)節(jié)2，4-D與6-BA的配比)以抑制細(xì)胞壁纖維素的合成并促進(jìn)中膠層中果膠質(zhì)的水解。

3 結(jié)論與討論

植物細(xì)胞壁由多糖類、木質(zhì)素、結(jié)構(gòu)蛋白、無機(jī)離子等相互連接而成，而多糖類根據(jù)化學(xué)提取的難易程度可分為果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素。而植物組織的疏松或致密程度主要與果膠質(zhì)和纖維素有密切關(guān)系。果膠質(zhì)主要位于細(xì)胞間中膠層，是粘結(jié)相鄰細(xì)胞、使組織堅(jiān)實(shí)的重要成分；纖維素是細(xì)胞壁的主要成分，是維持植物細(xì)胞形態(tài)、增強(qiáng)細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的物質(zhì)，因其具有剛性而在一定程度上限制細(xì)胞的生長(zhǎng)。在植物組織培養(yǎng)進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖過程中，有時(shí)需要獲得疏松愈傷組織，尤其是通過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)同步化誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚用于人工種子生產(chǎn)時(shí)，疏松愈傷組織更是必不可少。然而，很多植物的組織培養(yǎng)卻難以得到疏松愈傷組織，半夏就是其中之一[8-9，15]。眾所周知，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在愈傷組織誘導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的適宜配比可有效地誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生[16-17]，常用的生長(zhǎng)素有2，4-D和NAA等[18-19]，細(xì)胞分裂素有6-BA和KT等[20]。本研究通過2，4-D與6-BA組合試驗(yàn)，篩選出了誘導(dǎo)半夏疏松愈傷組織的最佳激素組合，即在基本培養(yǎng)基中添加1 mg/L 2，4-D和1 mg/L 6-BA。當(dāng)然，影響植物組織疏松與致密的因素可能還有很多，尚需進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(2010版一部)[M]. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2010.

[2] Hu XF， Fang QL， Li SX，etal. Isolation and characterization of endophytic and rhizosphere bacterial antagonists of soft rot pathogen fromPinelliaternata.[J].FEMSMicrobiologyLetters， 2009， 295(1)： 101-106.

[3] 馬小軍， 李西文， 杜 鵑， 等. 加權(quán)打分法定量評(píng)價(jià)半夏種質(zhì)資源的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2006， (12)： 975-977.

[4] 章艷玲， 李關(guān)榮， 位運(yùn)糧. 中藥半夏的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2007， 23(7)： 163-167.

[5] 賈君君， 李 婷， 李 敏， 等. 影響半夏產(chǎn)量因素分析[J]. 世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化)， 2009， 11(04)： 562-565.

[6] 李 花， 張明生， 彭斯文， 等. 半夏不同種植模式的經(jīng)濟(jì)效益分析[J]. 世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化)， 2009， 11(04)： 566-569.

[7] 薛建平， 張愛民， 盛 瑋， 等. 半夏人工種子貯藏技術(shù)的研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2005， 30(30)： 1820-1823.

[8] 張明生， 李 花. 半夏人工種子制作技術(shù)及其萌發(fā)研究[J]. 種子， 2009， 28(11)： 4-6， 10.

[9] 申起飛， 張明生， 李立青， 等. 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)半夏人工種胚形成的影響[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)， 2014， 33(03)： 33-36.

[10] 程杰山， 沈火林， 楊學(xué)妍， 等. 不同硬度辣椒品系果實(shí)組織結(jié)構(gòu)觀察與細(xì)胞壁物質(zhì)含量測(cè)定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2008， 17(1)： 150-156.

[11] 李正理. 植物制片技術(shù)(第二版)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1978.

[12] 趙 偉， 杜映達(dá)， 國(guó) 微， 等. 北五味子果實(shí)中果膠的超聲提取工藝研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2014， 26(08)： 1316-1320.

[13] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[14] 安玉民， 王菊葵， 黃 燁， 等. 馬鈴薯秸稈中纖維素與半纖維素含量的測(cè)定[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2016 (17)： 159-160.

[15] 劉貴賢， 張明生， 李小蘭， 等. 適于懸浮培養(yǎng)的半夏疏松愈傷組織誘導(dǎo)及增殖技術(shù)[J]. 山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)， 2016， 35(01)： 82-85， 94.

[16] 李代麗， 康向陽. 植物愈傷組織培養(yǎng)中內(nèi)外源激素效應(yīng)的研究現(xiàn)狀與展望[J]. 生物技術(shù)通訊， 2007 (03)： 546-548.

[17] 王小菁. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010.

[18] 黃衡宇， 王美蓉. 紫背金盤愈傷組織誘導(dǎo)與再生體系的建立[J]. 中草藥， 2014， 45(09)： 1313-1318.

[19] 韋 瑩， 黃雪彥， 韋坤華， 等. 箭根薯愈傷組織誘導(dǎo)及無性系的建立[J]. 中草藥， 2013， 44(17)： 2466-2470.

[20] 李浚明， 朱登云， 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2005.