賴 勇，呂仲昱，賈建磊，盧九斤，王晉民，朱惠琴，馬 輝，田 豐，楊莉娜，李宗仁

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016；2.三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧 810016；3.甘肅隆源農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，甘肅蘭州 730070)

大麥?zhǔn)乔嗖馗咴闹髟宰魑镏弧＿z傳基礎(chǔ)狹窄是目前大麥育種家面臨的嚴(yán)重困境[1]，而引進(jìn)種質(zhì)資源是解決該問題的有效手段。借助分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)引進(jìn)的種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析，發(fā)掘不同材料所含的有利等位變異，對(duì)于作物育種的親本選擇、組合配制和標(biāo)記輔助育種具有重要意義?；赟SR標(biāo)記的遺傳多樣性、基因定位和關(guān)聯(lián)分析在各類作物中廣泛應(yīng)用[2-4]。國(guó)內(nèi)外也有許多關(guān)于大麥SSR遺傳多樣性分析的報(bào)道[5-7]。通過關(guān)聯(lián)分析尋找與目標(biāo)性狀相關(guān)的位點(diǎn)，分析其對(duì)目標(biāo)性狀的貢獻(xiàn)率是發(fā)掘有利基因的主要方法[8-12]。但是目前，大量關(guān)聯(lián)分析都停留在標(biāo)記或位點(diǎn)水平，鮮有具體分析相關(guān)位點(diǎn)各等位變異的表型效應(yīng)。對(duì)于SSR位點(diǎn)，在自然群體中通常能檢測(cè)到多個(gè)等位變異，每個(gè)等位變異的遺傳效應(yīng)存在差異[13-14]。分析每一個(gè)等位變異的表型效應(yīng)對(duì)于分子標(biāo)記輔助選擇育種具有指導(dǎo)意義。Breseghello和Sorrells[13]在進(jìn)行小麥籽粒直徑及磨粉品質(zhì)與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析中，以無效等位基因(null allele)材料為對(duì)照，分析各等位變異的表現(xiàn)效應(yīng)值，發(fā)掘出其中可以增大籽粒直徑和提高磨粉品質(zhì)的有利基因。此方法給作物關(guān)聯(lián)作圖中，具體分析不同等位基因的表型效應(yīng)、發(fā)掘有利基因提供了新思路。Zhang等[14]利用Breseghello和Sorrells[13]的方法尋找到降低小麥株高的有利等位變異。文自翔等[15]采用該方法從我國(guó)栽培大豆和野生大豆中鑒定出許多與農(nóng)藝性狀以及品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的優(yōu)異等位變異。在大麥上，還未見基于SSR位點(diǎn)對(duì)引進(jìn)種質(zhì)不同等位變異表型效應(yīng)進(jìn)行分析的報(bào)道。

本研究在以前對(duì)大麥引進(jìn)國(guó)外種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性和GLM關(guān)聯(lián)分析[16]的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用MLM關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)大麥農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，并分析關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上不同等位變異的表型效應(yīng)，以期為青海省大麥分子標(biāo)記輔助選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 種植材料及農(nóng)藝性狀鑒定

55份國(guó)外引進(jìn)大麥品種包括19份丹麥品種、12份匈牙利品種、12份德國(guó)品種以及少量其他國(guó)外引進(jìn)栽培品種，分別于2014年3月29日、2015年3月28日種植于青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院試驗(yàn)地。這些材料為沒有直接親緣關(guān)系的自然群體，符合關(guān)聯(lián)分析發(fā)掘有利等位變異的條件。材料名稱、來源及種植情況等詳見文獻(xiàn)[16]。于分蘗期采幼嫩葉片，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ诟鞑牧铣墒旌?，每個(gè)材料隨機(jī)抽取10個(gè)單株，測(cè)定株高、穗長(zhǎng)、穗下莖長(zhǎng)、千粒重、全生育期等農(nóng)藝性狀。各材料具體農(nóng)藝性狀指標(biāo)已在文獻(xiàn)[16]中報(bào)道。

1.2 混合模型關(guān)聯(lián)分析

通過軟件SPAGeDi構(gòu)建親緣關(guān)系矩陣(K)，結(jié)合前文GLM分析中獲得的Q參數(shù)[16]，以Q+K的方法采用混合線性模型(mixed linear model，MLM)在Tassel 2.1 軟件中運(yùn)行，檢測(cè)與農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，P<0.01時(shí)為陽(yáng)性關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。以軟件Origin 8.0繪制關(guān)聯(lián)位點(diǎn)圖。

1.3 等位變異表現(xiàn)效應(yīng)分析

參考Breseghello和Sorrells[13]提出的無效等位變異(null allele)方法，區(qū)分有效等位變異和無效等位變異，對(duì)MLM模型中與農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，分析其不同等位變異的表型效應(yīng)。具體表型效應(yīng)計(jì)算方法：

ai=∑xij/ni-∑Nk/nk

式中ai為第i個(gè)等位變異的表型效應(yīng)值，xij表示含有第i個(gè)等位變異的第j個(gè)材料性狀表型測(cè)定值，ni為含有第i個(gè)等位變異的材料數(shù)，Nk為攜帶無效等位變異的第k個(gè)材料的表型測(cè)定值，nk為具有無效等位變異的材料數(shù)。若ai值為正， 則認(rèn)為該等位變異為正向(或增效)等位變異，反之為負(fù)向(或減效)等位變異。以軟件Origin 8.0繪制效應(yīng)值柱形圖。

當(dāng)某性狀同時(shí)有多個(gè)正向(或負(fù)向)等位變異或多個(gè)相關(guān)聯(lián)位點(diǎn)時(shí)，參考文自翔等[15]方法計(jì)算各位點(diǎn)全部增效或減效等位變異的平均效應(yīng)[average positive(negative)allele effect of locus，AAE]，評(píng)價(jià)該位點(diǎn)的整體增效或減效能力。

AAE=∑ac/nc

式中ac為某關(guān)聯(lián)位點(diǎn)內(nèi)第c個(gè)增效(或減效)等位變異表型效應(yīng)值，nc為位點(diǎn)內(nèi)增效(或減效)等位變異數(shù)。增效(或減效)比例：AN=AAE∑NK/nK×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 MLM關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

經(jīng)MLM關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到15個(gè)與株高、穗長(zhǎng)、穗下莖長(zhǎng)、千粒重和全生育期關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)(P<0.01)，其中位點(diǎn)GBMS2和HVM33均與穗長(zhǎng)和千粒重相關(guān)聯(lián)，位點(diǎn)HVM33、HVM60和Bmac316均與千粒重相關(guān)聯(lián)(P<0.001)(圖1、表1)。各位點(diǎn)分別位于除1H、5H外的其余5條染色體上，不同位點(diǎn)對(duì)表型變異的解釋率變化范圍為3.19%～24.30%(表1)。與千粒重相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)最多，有6個(gè)，只有一個(gè)位點(diǎn)HV13GEIII與全生育期關(guān)聯(lián)。

圖1 與所測(cè)農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的15個(gè)SSR位點(diǎn)

Table1ContributionoflocustoagronomictraitsunderMLM

位點(diǎn)Locus染色體Chromosome圖距Position/cM農(nóng)藝性狀A(yù)gronomictrait/%株高Plantheight穗長(zhǎng)Spikelength穗下莖長(zhǎng)Lengthofearstem千粒重Thousandkernelweight全生育期DaystomaturityGBMS22HS506．6317．6624．30EBmac6842HL803．22Bmag1252HL12214．99HVM333HL9416．0914．41HVM603HL11017．07HV13GEIII3HL15512．59Bmac293HL1901．88EBmac7754HL803．19HVJASIP4HL1801．42Bmac3166HS620．31GMS066HL9612．17GBM10876HL12817．61Bmac406HL15517．88Bmag77HS273．42EBmac6037HS503．66

下劃線表示在0.001水平相關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

The underlined number showed locus associated with agronomic trait at 0.001 level.

2.2 等位變異表型效應(yīng)分析

15個(gè)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，HVM33、Bmac40、EBmac775、EBmac603、Bmag125、HVM60和Bmac1367位點(diǎn)上檢測(cè)到無效等位基因。這7個(gè)位點(diǎn)上共有22個(gè)不同有效等位變異，其中Bmac40-2、EBmac755-2和EBmac755-4等6個(gè)等位變異對(duì)表型具有正向效應(yīng)，其余均為負(fù)向效應(yīng)(圖1)。與穗長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)HVM33和Bmac40上共檢測(cè)到1個(gè)具有正向效應(yīng)的等位變異和6個(gè)具有負(fù)向效應(yīng)的等位變異(圖2A)，且負(fù)向效應(yīng)明顯大于正向效應(yīng)。與株高相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)上共檢測(cè)到3個(gè)具有正向效應(yīng)的等位變異和5個(gè)具有負(fù)向效應(yīng)的等位變異(圖2B)，其中等位變異EBmac775-4的正向效應(yīng)值最大(+31.7 cm)，EBmac603-5具有最大負(fù)向效應(yīng)(-25.6)。與千粒重相關(guān)聯(lián)的3個(gè)位點(diǎn)上共檢測(cè)到10個(gè)有效等位變異，其中2個(gè)為正向效應(yīng)，8個(gè)為負(fù)向效應(yīng)(圖2C)。

2.3 整體平均效應(yīng)分析結(jié)果

在7個(gè)相關(guān)聯(lián)位點(diǎn)中，等位變異平均效應(yīng)以負(fù)向?yàn)橹?表2)。與穗長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)的2個(gè)位點(diǎn)HVM33和Bmac40上，等位變異平均效應(yīng)均為負(fù)向，且平均效應(yīng)差異較小，分別為-1.6 cm 和-1.0 cm。與株高相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中，EBmac775的等位變異平均效應(yīng)為+16.91 cm，EBmac603為-13.35 cm。與千粒重相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)中，HVM60等位變異平均效應(yīng)為正向，HVM33、Bmag125和Bmac316三位點(diǎn)的等位變異平均效應(yīng)均為負(fù)向。

圖2 穗長(zhǎng)、株高和千粒重關(guān)聯(lián)位點(diǎn)等位變異表型效應(yīng)

Table2Averageeffectsofallelicvariationsassociatedwithspikelength,plantheightandthousandkernelweight

性狀Trait位點(diǎn)Locus平均效應(yīng)Averageeffect正向Positiveeffect負(fù)向Negativeeffect穗長(zhǎng)Spikelength/cmHVM33--1．6(-17．78)Bmac40--1(-11．11)株高Plantheight/cmEBmac775+13(+16．91)-EBmac603--13．35(-14．05)千粒重Thousandkernelweight/gHVM33--8．2(-15．80)Bmag125--3．8(-8．14)HVM60+19．03(+58．3)-Bmac316--3．3(-6．79)

括號(hào)內(nèi)為與無效等位變異相比較的平均正向(或負(fù)向)效應(yīng)占的比例(%)。

The number in parentheses indicates the proportion(%) of average positive(negative) allele effect of locus compared with the effect of null allele.

3 討 論

對(duì)引進(jìn)種質(zhì)資源進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析以發(fā)掘有利等位變異，是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)。本研究采用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)國(guó)外引進(jìn)的大麥品種進(jìn)行MLM關(guān)聯(lián)分析和等位變異表型效應(yīng)分析，為后期大麥分子標(biāo)記輔助育種提供了一定的理論依據(jù)。一些研究結(jié)果表明，關(guān)聯(lián)分析中的MLM模型比GLM模型的結(jié)果準(zhǔn)確，可以更有效地降低偽關(guān)聯(lián)[17-19]。本研究在前文的基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用MLM模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到15個(gè)與株高、穗長(zhǎng)、千粒重等農(nóng)藝性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)，與GLM模型相比[16]，檢測(cè)到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)有所減少，且各位點(diǎn)對(duì)表型的解釋率明顯低于GLM模型。因此，在進(jìn)行等位變異的表型效應(yīng)分析中，集中于MLM模型中檢測(cè)到的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。

具體分析某一位點(diǎn)等位變異的效應(yīng)值，有助于發(fā)掘其中的有利等位變異，為分子標(biāo)記輔助育種提高更詳細(xì)的依據(jù)。魏添梅等[20]以抗旱小麥材料為對(duì)象進(jìn)行分子標(biāo)記與株高的關(guān)聯(lián)作圖時(shí)，以優(yōu)良材料含有的等位變異作為優(yōu)異等位變異。但是這種方法不能具體分析每一個(gè)等位變異的表型效應(yīng)值，不能給分子標(biāo)記后期輔助選擇提供更翔實(shí)的依據(jù)。這種分析方法僅對(duì)于沒有檢測(cè)到無效等位變異的位點(diǎn)具有一定的借鑒意義。當(dāng)檢測(cè)到無效等位變異的位點(diǎn)時(shí)，采用Breseghello和Sorrells[13]的方法更具優(yōu)勢(shì)。因此在進(jìn)行等位變異表型效應(yīng)分析時(shí)，可以綜合兩種方法評(píng)價(jià)種質(zhì)資源所含等位變異的優(yōu)異程度。本研究從不同位點(diǎn)上共檢測(cè)到7個(gè)無效等位變異，以之為對(duì)照，對(duì)每個(gè)有效等位變異的表型效應(yīng)進(jìn)行具體分析。穗長(zhǎng)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)上，只有等位變異Bmac40-2具有正向效應(yīng)(+0.4 cm)，是增加穗長(zhǎng)優(yōu)異等位變異。株高關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)上，有5個(gè)可以降低株高的優(yōu)異等位變異，以等位變異EBmac603-4(-17.6 cm)和EBmac603-5(-25.6 cm)最顯著。千粒重關(guān)聯(lián)的等位變異中，只有HVM60-1和HVM60-12，為正向效應(yīng)，效應(yīng)值分別為+13.5 g和+12.0 g，可以作為提高千粒重的優(yōu)異候選等位變異。在分子標(biāo)記后期標(biāo)記輔助選擇時(shí)，在穗長(zhǎng)方面，可以標(biāo)記Bmac40進(jìn)行檢測(cè)，含有Bmac40-2等位變異的個(gè)體則具有較大穗長(zhǎng)的趨勢(shì)；在千粒重方面，可以標(biāo)記HVM60進(jìn)行檢測(cè)，含有HVM60-1和HVM60-12等位變異個(gè)體的千粒重將更大。

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