孫 婧 黃力勤 劉正敏 王 瑞

核酸檢測(cè)(nucleic acid amplification testing，NAT)因其對(duì)病毒檢測(cè)的高度特異性和靈敏度，目前已成為采供血機(jī)構(gòu)血液篩查中最為有效的檢測(cè)技術(shù)，并得到了廣泛的推廣和應(yīng)用。根據(jù)國家衛(wèi)生計(jì)生委頒布的“血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)”[1]中對(duì)核酸檢測(cè)的規(guī)定，進(jìn)行核酸檢測(cè)的標(biāo)本應(yīng)在72 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。然而，由于Ultrio Plus核酸檢測(cè)試劑的特殊性，分為人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)聯(lián)合檢測(cè)和鑒別檢測(cè)，血站實(shí)驗(yàn)室一般可在72 h內(nèi)完成聯(lián)合檢測(cè)并發(fā)放報(bào)告，但對(duì)于鑒別檢測(cè)，各血站進(jìn)行檢測(cè)的時(shí)限不盡相同，有時(shí)會(huì)因?yàn)橐恍┨厥庠蛐枰獙?biāo)本保存較長(zhǎng)時(shí)間才能進(jìn)行核酸鑒別檢測(cè)。然而，目前尚未對(duì)于核酸鑒別檢測(cè)前標(biāo)本保存條件的研究，尤其缺乏低病毒載量標(biāo)本的保存條件的研究，因此，本研究選取3倍檢測(cè)限(limit of detection，LOD)和0.5倍LOD兩種濃度的HIV-1弱陽性標(biāo)本，通過評(píng)估不同保存溫度和保存時(shí)間下鑒別檢測(cè)的陽性率，來確定核酸鑒別檢測(cè)前合理的標(biāo)本保存條件。

1 材料和方法

1.1 檢測(cè)試劑

Ultrio Plus HIV-1鑒別檢測(cè)試劑(美國Grifols公司，批號(hào)：156796，有效期：2018.02.15)。

1.2 標(biāo)本來源

采用60 IU/ml(3倍LOD)和5 IU/ml(0.5倍LOD)的兩組HIV-1陽性樣本各6支，每支3 ml。樣本為世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)10/152標(biāo)準(zhǔn)品稀釋(北京康徹斯坦公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

TIGRIS核酸檢測(cè)系統(tǒng)(美國Grifols公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

按照常規(guī)血液檢測(cè)流程對(duì)60 IU/ml和5 IU/ml的HIV-1 WHO標(biāo)本進(jìn)行核酸HIV-1 RNA鑒別檢測(cè)，每支樣品檢測(cè)5次，每種濃度的樣品共檢測(cè)30次，計(jì)算兩組標(biāo)本的HIV-1陽性檢出率。再將兩組標(biāo)本分別放置在在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃冰箱內(nèi)，分別在保存1 d、3 d和7 d時(shí)取出，進(jìn)行與上述方法相同的30次核酸檢測(cè)，并計(jì)算HIV-1陽性檢出率，以0 d保存標(biāo)本的陽性檢出率作為對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)標(biāo)本保存溫度和時(shí)間對(duì)HIV-1鑒別檢測(cè)陽性檢出率的影響進(jìn)行x2檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 保存條件對(duì)3倍LOD HIV陽性標(biāo)本鑒別檢出率的影響

結(jié)果顯示，3倍LOD HIV陽性標(biāo)本即在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下保存7 d，可以100%檢出。

2.2 保存條件對(duì)0.5倍LOD HIV陽性標(biāo)本鑒別檢出率的影響

(1)0.5倍LOD HIV-1陽性標(biāo)本在3種不同溫度下保存1 d后，陽性檢出率基本保持不變；保存3 d后，4 ℃和-20 ℃條件下的標(biāo)本陽性檢出率已明顯開始下降，下降程度達(dá)5%以上，甚至4 ℃條件的標(biāo)本檢出率已降至50%以下，而此時(shí)-80 ℃條件的標(biāo)本陽性檢出率仍未出現(xiàn)明顯改變；到了第7 d，只有-80 ℃條件下的標(biāo)本陽性檢出率仍維持在50%以上，而其余兩種溫度條件下標(biāo)本陽性檢出率已降至50%以下。

(2)在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下保存0.5倍LOD HIV-1陽性標(biāo)本7 d，3種溫度條件下標(biāo)本的陽性檢出率均明顯下降，僅-80 ℃條件下陽性檢出率與0 d對(duì)照一致，仍為56.67%，并且以4 ℃條件下標(biāo)本陽性檢出率下降最為顯著，該保存溫度保存7 d相對(duì)于0 d對(duì)檢出率的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.34，P＜0.05)；而-20 ℃和-80 ℃兩個(gè)溫度下標(biāo)本檢出率雖有不同程度的下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=1.67，x2=0.00；P＞0.05)，見表1。

表1 5 IU/ml(0.5倍LOD)HIV陽性標(biāo)本在不同保存溫度和時(shí)間下檢出率[%(次)]

3 討論

血液核酸檢測(cè)是直接對(duì)病原體核酸進(jìn)行提取、擴(kuò)增和檢測(cè)等一系列檢測(cè)技術(shù)的總稱，具有對(duì)病原體檢測(cè)靈敏度和特異性高，且能有效縮短病毒感染后檢測(cè)“窗口期”等特點(diǎn)[2-4]。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)“全血及成分血質(zhì)量要求”[5]的規(guī)定，對(duì)臨床用血進(jìn)行HBV、HCV和HIV等病原體的篩查檢測(cè)時(shí)，除常規(guī)的免疫學(xué)檢測(cè)外還需進(jìn)行病毒的核酸檢測(cè)。由于血液在離開人體后，血液內(nèi)的病毒核酸物質(zhì)經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間放置之后會(huì)逐漸降解，當(dāng)病毒載量降至核酸檢測(cè)試劑的最低LOD甚至更低時(shí)，有可能會(huì)被漏檢[6-8]。因此“血站技術(shù)操作規(guī)程(2015版)”[1]規(guī)定，核酸檢測(cè)應(yīng)在72 h內(nèi)進(jìn)行。但是在實(shí)際的血液篩查工作中，應(yīng)用Ultrio Plus試劑的實(shí)驗(yàn)室，需在72 h內(nèi)完成核酸聯(lián)檢后，還需進(jìn)行鑒別檢測(cè)才能最終判定標(biāo)本所攜帶的病原體類型。而對(duì)于鑒別檢測(cè)前的保存條件卻無統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，血站根據(jù)其試劑使用和聯(lián)檢陽性率選擇進(jìn)行鑒別檢測(cè)間隔時(shí)間。此外，雖然核酸聯(lián)檢陽性標(biāo)本將進(jìn)行報(bào)廢處理，但最終的鑒別檢測(cè)結(jié)果將影響后續(xù)對(duì)獻(xiàn)血者的追蹤工作。目前，對(duì)核酸標(biāo)本檢測(cè)前保存條件的研究報(bào)道僅限于對(duì)聯(lián)檢檢測(cè)前的研究，尚無對(duì)鑒別檢測(cè)前保存條件的研究和報(bào)道[9-11]。

本研究以HIV RNA為代表研究標(biāo)本保存條件對(duì)鑒別檢測(cè)的影響，其原因?yàn)椋孩貶IV RNA相對(duì)HCV RNA和HBV DNA穩(wěn)定性差，易受環(huán)境因素的影響，具有代表性[10]；②因目前只有HIV感染的獻(xiàn)血者由疾病控制部門進(jìn)行追蹤，這依賴于鑒別檢測(cè)結(jié)果，具有現(xiàn)實(shí)意義。此外，本研究重點(diǎn)分析了鑒別前保存條件對(duì)低病毒載量HIV RNA的影響，而對(duì)高載量HIV病毒已有相關(guān)研究[9，12]。

本研究中，首先分析了環(huán)境因素對(duì)3倍LOD的低載量HIV病毒標(biāo)本的影響，60 IU/ml(3 LOD)的標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，在3種溫度條件下放置7 d后仍然能100%被檢出，表明這3種保存溫度保存7 d并無明顯影響標(biāo)本的病毒載量，這與文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[7，12]。同時(shí)，本研究將極低濃度(5 IU/ml，0.5 LOD)HIV-1標(biāo)本同樣在3種不同的溫度下放置了7 d，核酸檢測(cè)的結(jié)果與3倍LOD的標(biāo)本截然不同。Procleix Utrio Plus試劑說明書標(biāo)示的50%檢出限所需的病毒濃度為4.7 IU/ml(95%置信區(qū)間4.0～5.7 IU/ml)，因此，理論上5 IU/ml濃度的血清標(biāo)本，核酸檢測(cè)的陽性檢出率應(yīng)該在50%左右。檢測(cè)結(jié)果顯示，在初始條件下，所有標(biāo)本的陽性檢出率均在50%以上，與Procleix Utrio Plus Assay產(chǎn)品說明及文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為一致[13]。在經(jīng)過1 d的保存之后，所有標(biāo)本的陽性檢出率均未出現(xiàn)明顯的下降。保存了3 d之后，3組檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)了一些差異，4 ℃條件下保存的標(biāo)本陽性檢出率已略＜50%，而其余兩個(gè)溫度下檢出率均在50%以上，并且4 ℃和-20 ℃條件下標(biāo)本陽性檢出率的下降幅度已＞5%，4 ℃內(nèi)的標(biāo)本檢出率已降至50%以下，而-20 ℃內(nèi)的標(biāo)本仍能維持50%的檢出率，表明病毒載量極低的標(biāo)本在-20 ℃以下的條件下保存3 d再進(jìn)行鑒別檢測(cè)，并不會(huì)明顯影響檢出效率，但保存在4 ℃條件下則可能會(huì)導(dǎo)致漏檢率的升高。然而，保存7 d之后，僅-80 ℃條件下保存的標(biāo)本陽性檢出率仍能保持在50%以上，其他兩組標(biāo)本均未達(dá)到50%的檢出率，并且4 ℃條件下將鑒別標(biāo)本保存7 d對(duì)其陽性檢出率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明保存在該溫度下會(huì)造成陽性檢出率明顯地下降。而-20 ℃條件下標(biāo)本陽性檢出率也已經(jīng)下降到50%以下，下降幅度＞15%，因此-20 ℃的條件也并不適合將鑒別檢測(cè)的標(biāo)本保存7 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鑒別檢測(cè)標(biāo)本若需要保存7 d，則保存于-80 ℃的條件下更為合適。

根據(jù)本次檢測(cè)主要考慮鑒別檢測(cè)前保存的時(shí)間和溫度條件是影響其陽性檢出率的主要因素，而這兩種因素影響檢出率的原因可能主要是因?yàn)樵谳^高溫度和長(zhǎng)時(shí)間的保存中，極低濃度的HIV病毒核酸穩(wěn)定性較差，更容易降解，造成濃度進(jìn)一步降低以致于應(yīng)用常規(guī)的核酸檢測(cè)試劑和系統(tǒng)檢測(cè)富集不到足夠拷貝數(shù)的病毒核酸，則檢測(cè)系統(tǒng)將其判定為非反應(yīng)性。因此，盡管核酸檢測(cè)能比酶免方法在病毒感染后更短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)到病毒核酸，但是對(duì)低病毒載量的標(biāo)本仍有漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，可能酶免檢測(cè)與核酸檢測(cè)相結(jié)合的方式更有利于保障血液的安全[12-15]。影響鑒別檢測(cè)結(jié)果的除標(biāo)本的保存溫度和時(shí)間外，可能還有保存的試管、標(biāo)本離心的時(shí)間和轉(zhuǎn)速等其他許多因素，尚需要進(jìn)一步研究和探討。

采用60 IU/ml的HIV-1標(biāo)本保存7 d，鑒別檢測(cè)的陽性檢出率均為100%，表明3倍LOD以上濃度的HIV-1標(biāo)本無論在何種溫度放置7 d均可完全被檢出。但是5 IU/ml的低濃度HIV-1標(biāo)本，在4 ℃和-20 ℃放置7 d會(huì)嚴(yán)重影響鑒別檢測(cè)的檢出率，而-80 ℃的溫度條件下將鑒別標(biāo)本放置7 d后陽性檢出率并未明顯下降，表明-80 ℃的條件更有利于低濃度的鑒別檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間保存，使陽性標(biāo)本能有效地被檢出，從而更有效地保障血液安全。

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