王喜娜 王敏 孔繁芳 王忠躍 張昊

摘要

葡萄霜霉病是葡萄最重要的病害之一，目前防治霜霉病主要依賴化學藥劑，其中羧酸酰胺類殺菌劑是一類重要藥劑，然而病原菌抗藥性對其防效有重要影響。2015年本實驗室首次在中國檢測到抗烯酰嗎啉的葡萄霜霉菌，并開發(fā)了TetraPrimer ARMS PCR快速檢測法來檢測抗藥性。本研究利用此技術對采自山西省清徐縣60株葡萄霜霉菌進行了烯酰嗎啉抗性檢測，結(jié)果顯示其中1株具有抗藥性，其他59株均為敏感菌株，說明該地區(qū)霜霉菌已經(jīng)開始產(chǎn)生烯酰嗎啉抗性，但尚未大范圍擴展，需要進行持續(xù)監(jiān)測以指導殺菌劑的使用，這也是首次報道山西省葡萄霜霉菌存在烯酰嗎啉抗性菌株。

關鍵詞

葡萄霜霉菌； TetraPrimer ARMS PCR技術； 烯酰嗎啉； 抗藥性

中圖分類號：

S 436.631.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017090

Identification of the dimethomorphresistant isolates of Plasmopara

viticola populations in Qingxu， Shanxi Province

WANG Xina1， WANG Min2， KONG Fanfang1， WANG Zhongyue1， ZHANG Hao1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China；

2. Shanxi Academy of Agricultural Sciences Pomology Institute， Taiyuan 030031， China）

Abstract

Grape downy mildew is one of the most important diseases of grape. Chemical control is the most effective strategy for controlling this disease so far and carboxylic acid amide （CAA） fungicides are the main agents. However， the efficacy of CAAs in the field is limited due to developmental resistance of pathogen. In 2015， we detected dimethomorphresistant Plasmopara viticola in China for the first time and developed the TetraPrimer ARMS PCR method for dimethomorphresistance detection. Based on this method， 60 isolates of P.viticola collected from Qingxu County of Shanxi Province were identified.The results showed that one strain was resistant to dimethomorph and the others were all sensitive， indicating the presence of dimethomorphresistant P.viticola in this region. Although the low resistance frequency suggested that the resistance allele had not spread widely， continuous monitoring is required for the use of fungicides. This is also the first report of dimethomorphresistant strains of P.viticola in Shanxi.

Key words

Plasmopara viticola； tetraprimer ARMS PCR； dimethomorph； fungicide resistance

葡萄霜霉病是由葡萄單軸霜霉Plasmopara viticola （Berk et Curtis） Berl.et de Toni引起的。該病原菌為專性寄生菌[1]，屬于卵菌門、卵菌綱、霜霉目、霜霉科、單軸霉屬[2]。葡萄霜霉菌可以侵染葡萄的任何綠色部分或組織，如葉片、嫩梢、幼果等，造成品質(zhì)降低、產(chǎn)量下降，嚴重時絕產(chǎn)絕收，對我國的葡萄種植業(yè)和葡萄酒釀造業(yè)產(chǎn)生嚴重影響[3]。目前，葡萄霜霉病的防治措施有：選用抗性品種、預報預警、化學防治、生物防治、切斷侵染途徑的避雨栽培措施等，其中化學防治是最主要的防治手段。

羧酸酰胺類殺菌劑是防治霜霉病的主要化學藥劑之一，是一類單靶標位點的化學農(nóng)藥，包括烯酰嗎啉、雙炔酰菌胺和氟嗎啉等，其中烯酰嗎啉是該類殺菌劑中最早被研發(fā)成功并投入市場的。研究發(fā)現(xiàn)烯酰嗎啉對霜霉病有特效且與甲霜靈和苯酰胺類殺菌劑無交互抗性，因此被廣泛使用[4]。羧酸酰胺類殺菌劑主要作用機理是抑制孢子囊形成。纖維素合酶3（CesA3）是其作用的靶標[5]。目前，葡萄霜霉菌對羧酸酰胺類殺菌劑的抗性機制已經(jīng)明確，抗性菌株CesA3基因的1105位密碼子出現(xiàn)單堿基突變[6]。

葡萄霜霉病對殺菌劑的抗性檢測通常采用葉盤法[7]，這種方法存在檢測周期長、效率低、工作量大且穩(wěn)定性差等缺點。隨著對羧酸酰胺類殺菌劑抗性機制的解析，采用分子方法進行病原菌對其抗性頻率檢測成為可能?；谝痿人狨０奉悮⒕鷦┛剐缘膯魏塑账狳c突變，Aoki等報道了PCRRFLP方法[8]，顯著提高了檢測效率，但此方法也存在一些固有的弊端，比如在聚合酶鏈式反應擴增后需要一步額外的限制性內(nèi)切酶溶解來區(qū)分抗藥型和敏感型等位基因。針對這一問題，本實驗室建立了基于抗性突變的Tetraprimer ARMS PCR檢測法[9]，該方法在一個聚合酶鏈式反應中加入兩對引物，

其中一對為針對抗性和敏感等位基因的內(nèi)引物，另一對為外引物。在反應中外引物和內(nèi)引物可以相互反應擴增出不同長度的產(chǎn)物并通過凝膠電泳將其區(qū)分。Tetraprimer ARMS PCR方法可以通過一個反應區(qū)分抗性和敏感的純合子菌株以及敏感雜合子，快速準確。

病原菌對殺菌劑的抗性頻率監(jiān)測對于指導田間殺菌劑的合理使用、提高防效具有重要意義。近年來，由于化學藥劑的連續(xù)頻繁使用，病原菌抗藥性越來越強，導致防效逐年下降，嚴重影響我國葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。Tetraprimer ARMS PCR是目前檢測葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉抗性最簡便高效的方法之一，利用該方法，本實驗室于2015年在我國廣西首次檢測到了烯酰嗎啉抗性菌株，但其他產(chǎn)區(qū)的抗性情況尚不明確。本研究利用此方法對2016年采集自山西省清徐縣葡萄霜霉菌進行了烯酰嗎啉抗藥性檢測，研究結(jié)果將為該地區(qū)防治葡萄霜霉病的殺菌劑的合理使用及霜霉菌抗藥性治理措施的制定提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的純培養(yǎng)

供試葡萄霜霉病菌株于2016年采自山西省清徐縣馬峪鄉(xiāng)西迎南風村的‘龍眼葡萄品種。田間采集新鮮、未使用殺菌劑的發(fā)病葉片，用無菌水沖洗3～4次后將葉背面向上置于1%的水瓊脂培養(yǎng)基上，放于溫度為21℃，光照條件為L∥D=16 h∥8 h，濕度為100%的光照培養(yǎng)箱內(nèi)保濕培養(yǎng)，待重新長出新鮮菌絲之后，在顯微鏡下挑取單孢子囊，將其接種在直徑為15 mm的‘里扎馬特葉盤上，然后置于培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，待葉盤上重新長出的新鮮霉層即為純培養(yǎng)的葡萄霜霉菌，將采摘的60株菌株均進行單孢分離純培養(yǎng)。

1.2 DNA的提取

用小毛刷將純培養(yǎng)的霉層刷至2 mL離心管中，置于-80℃冰箱凍存24 h后放于55～80℃烘箱中將其烘干。在干燥后的菌絲體內(nèi)加入適量的石英砂和玻璃珠，后將其放入MiniBeadbeater96研磨儀模塊，加入液氮冷凍，裝入研磨儀研磨1 min。將研磨好的菌絲利用OMEGA公司的EZ96真菌基因組DNA提取試劑盒（D339002）提取DNA。

1.3 Tetraprimers ARMS PCR檢測抗藥性

引物[9]Cesa3OF： 5′GCACAGCAGACATGGTTTTCCTT3′，Cesa3OR：5′GTCCAAAAGTGCAAAGTCCAACG3′，Cesa3IW：5′TACCTTTACGGCAAATGTGTGCG3′，Cesa3IM：5′GACAATGTAGACAACCAGCAACGATCT3′。兩條外引物Cesa3OF與Cesa3OR用來擴增敏感菌株與抗性菌株等位基因，目的條帶612 bp，Cesa3IW針對敏感菌株等位基因，與Cesa3OR一起擴增可得到238 bp的目的條帶，Cesa3IM針對抗性菌株等位基因，與Cesa3OF一起擴增可得到378 bp的目的條帶。

PCR體系（20 μL）：10 mmol/L TrisHCl，（pH 8.3），50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs，引物Cesa3OF和Cesa3OR各0.25 μmol/L，引物Cesa3IW和Cesa3IM各0.5 μmol/L，0.5 unit聚合酶（TaKaRa， Japan），20 ng基因組DNA。

PCR反應體系：95℃預變性2 min；95℃變性30 s， 63℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

將分離自山西省清徐縣的60株樣本進行純培養(yǎng)后提取其DNA。采用Tetraprimer ARMS PCR檢測其對烯酰嗎啉的抗性。結(jié)果顯示有59株同時含有612 bp和238 bp的擴增條帶，只有一株樣本同時含有612 bp和378 bp的擴增片段。

本實驗室前期研究[9]顯示，同時含有612 bp和238 bp以及同時含有612 bp和378 bp的菌株均為純合體，同時含有612 bp、238 bp及378 bp的菌株為雜合體。本實驗室通過傳統(tǒng)葉盤法驗證了純合的突變體對烯酰嗎啉具有抗性，而具有敏感等位基因的純合體和雜合體對烯酰嗎啉是沒有抗性的。山西省清徐縣的60株樣本均為純合體，其中59株含有葡萄霜霉菌纖維素合酶3的敏感等位基因，其對烯酰嗎啉敏感、無抗性，1株菌株對烯酰嗎啉具有抗性，這說明雖然該地區(qū)的抗性頻率不高，但已經(jīng)出現(xiàn)對烯酰嗎啉具有抗性的葡萄霜霉菌株。

3 討論

葡萄霜霉病是葡萄種植中的重要病害，幾乎存在于我國所有的葡萄生產(chǎn)園中，由于目前抗病的栽培品種較少，所以控制葡萄霜霉病主要依賴殺菌劑。然而，隨著殺菌劑的連續(xù)頻繁使用，葡萄霜霉菌逐漸產(chǎn)生抗藥性，導致殺菌劑防效下降。烯酰嗎啉在20世紀80年代開始投入市場，1994年Chabane等在法國葡萄園中首次發(fā)現(xiàn)了抗烯酰嗎啉的葡萄霜霉菌菌株[10]，隨后在意大利、瑞士等國也相繼發(fā)現(xiàn)抗性菌株[7，11]，抗性產(chǎn)生初期，由于抗性頻率較低，并未明顯影響防效，但隨著羧酸酰胺類殺菌劑種類和使用量不斷增加，菌株抗性頻率急劇上升[12]。1996年烯酰嗎啉在中國登記，至今已經(jīng)使用20多年，是我國葡萄霜霉病防治最主要的殺菌劑之一。在中國，葡萄霜霉菌殺菌劑抗性相關研究較少，2010年Sun等對采自全國7個省11個地區(qū)的葡萄霜霉菌進行烯酰嗎啉敏感性測定，未發(fā)現(xiàn)抗性菌株[13]。至2016年中國未見有關葡萄霜霉菌對烯酰嗎啉具有抗藥性的報道。2015年本實驗室在廣西資源縣的葡萄霜霉菌菌株中發(fā)現(xiàn)了對烯酰嗎啉具有抗藥性的菌株，這是國內(nèi)首次關于葡萄霜霉病菌對烯酰嗎啉具有抗性的報道[9]，但我國其他葡萄產(chǎn)區(qū)，是否存在抗性菌株，抗性頻率如何尚不清楚?？顾幮缘漠a(chǎn)生嚴重影響了藥劑的選擇，因此，檢測葡萄霜霉菌的抗性頻率對于田間殺菌劑的合理使用具有指導作用。

葡萄霜霉菌為專性寄生菌，它的生長需要寄主，培養(yǎng)條件較為嚴苛，用傳統(tǒng)方法檢測其抗性頻率，既耗費時間且其結(jié)果易受培養(yǎng)條件和藥劑質(zhì)量的影響。隨著部分殺菌劑抗性機制的明確，分子檢測技術被廣泛應用于抗性頻率的檢測，比如突變阻滯擴增系統(tǒng)（ARMS）、PCRRFLP等[1417]。本實驗室在前期工作中，根據(jù)已報道的引起烯酰嗎啉抗性的突變位點，開發(fā)了Tetraprimer ARMS PCR檢測方法，在一個反應中運用兩對特異引物進行擴增，通過擴增的片段大小來區(qū)分抗性菌株和敏感菌株的等位基因，該方法快速簡單，精確省時，并且通過葉盤法進行驗證，準確率達到100%[9]。

烯酰嗎啉屬于低中等抗性風險的藥劑，抗烯酰嗎啉菌株出現(xiàn)后，若連續(xù)單獨使用羧酸酰胺類殺菌劑數(shù)年，抗性頻率將急劇上升至近100%，其防效可能會完全喪失，但停止使用兩年后，抗性頻率會迅速下降。因此抗藥性監(jiān)測是指導此類殺菌劑的合理使用，對抗性群體進行有效治理以延長殺菌劑使用壽命的有效手段。本試驗所用的60株菌株中，檢測到一株抗性菌株，且未出現(xiàn)雜合菌株，表明該地區(qū)存在對烯酰嗎啉具有抗性的菌株。這一結(jié)果說明在此地區(qū)，烯酰嗎啉仍然具有優(yōu)秀的防效，推薦作為霜霉病的防治藥劑。對于抗性菌株的出現(xiàn)，雖然抗性頻率較低，并未影響烯酰嗎啉的防效，但仍然應該引起足夠重視，對抗性頻率進行連續(xù)監(jiān)測，在抗性頻率上升時，及時采取輪換用藥措施，防止抗性基因的擴展及抗性頻率的進一步上升，以減少霜霉病造成的損失。

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（責任編輯：楊明麗）