云南文山州首次在感病西葫蘆上檢測到番木瓜環(huán)斑病毒

孫媛　盧建霖　唐桂清　張全財(cái)　高偉　李文躍

摘要

為明確引起云南文山州廣南縣西葫蘆發(fā)生蕨葉、斑駁、泡狀斑等癥狀的病原，從采集的西葫蘆病樣中提取總RNA，利用RTPCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測及測序獲得大小為887 bp的片段；經(jīng)過BLAST序列同源性比對分析，該病原與番木瓜環(huán)斑病毒Papaya ringspot virus（PRSV）（KY996464）基因序列同源性達(dá)87%。由此可知，侵染文山州西葫蘆的病毒病原是番木瓜環(huán)斑病毒。

關(guān)鍵詞

西葫蘆； 檢測； 番木瓜環(huán)斑病毒

中圖分類號(hào)：

S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017350

First detection of Papaya ringspot virus on Cucurbita pepo in

Wenshan State of Yunnan Province

SUN Yuan， LU Jianlin， TANG Guiqing， ZHANG Quancai， GAO Wei， LI Wenyue

（Plant Protection and Quaratine Station in Wenshan State， Yunnan 663099， China）

Abstract

In order to confirm the pathogen of zucchini showed fern leaf， motley and bubble spot symptoms in Guangnan County， Wenshan State， Yunnan Province， the RNA was extracted from the collected samples， and the pathogen was detected using RTPCR. An 887 bp fragment was amplified and sequenced. The results of BLAST analysis showed that the sequence has high homologous （87%） with that of Papaya ringspot virus （PRSV）. Therefore， the pathogen causing the disease of zucchini in Wenshan State is Papaya ringspot virus （PRSV）.

Key words

Cucurbita pepo； detection； Papaya ringspot virus

西葫蘆Cucurbita pepo L.，也稱美洲南瓜，在云南大部分地區(qū)俗稱小瓜，原產(chǎn)北美洲南部，自19世紀(jì)中期由歐洲引入我國，現(xiàn)在我國各地已有較多品種廣泛種植，統(tǒng)計(jì)入庫的西葫蘆種質(zhì)資源已達(dá)398份 [1]。

2017年5月在田間病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)云南文山州廣南縣種植的西葫蘆出現(xiàn)葉片褪綠、畸形、蕨葉，同時(shí)果實(shí)也出現(xiàn)褪綠、斑駁、表面不平整、形成凸起泡狀斑等一系列癥狀，通過采集具有典型癥狀特征的發(fā)病西葫蘆植株，采用EZNA Plant RNA Kit提取總RNA，利用RTPCR技術(shù)對病樣進(jìn)行檢測和鑒定，結(jié)果表明引起廣南縣西葫蘆感病的病原物為番木瓜環(huán)斑病毒Papaya ringspot virus （PRSV），這是文山州首次發(fā)現(xiàn)番木瓜環(huán)斑病毒侵染西葫蘆。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

在文山州廣南縣田間病害調(diào)查中觀察到西葫蘆出現(xiàn)疑似病毒病的癥狀，對田間發(fā)病癥狀拍照并采集癥狀明顯的3株病樣，用于病原檢測、鑒定。

1.2 病原RTPCR檢測

提取樣品總RNA，采用RTPCR檢測病原。首先利用EZNA Plant RNA Kit獲得樣品總RNA，利用下游引物M4T逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈[2]。擴(kuò)增總體系為20 μL，反應(yīng)體系如下：總RNA 4 μL，下游引物M4T 2.5 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase Free ddH2O 2.5 μL，混合均勻，65℃水浴5 min，迅速置于冰上急冷30 s，加入5×Prime ScriptⅡ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime ScriptⅡ RTase 1 μL，RNase Free ddH2O 4.5 μL；反應(yīng)條件：42℃，90 min；72℃，15 min。利用2×Power Taq PCR Master Mix試劑盒，以cDNA產(chǎn)物為模板，用馬鈴薯Y病毒科特異性引物Sprimer/M4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[3]，擴(kuò)增總體系為50 μL，反應(yīng)體系如下：2×Power Taq PCR Master Mix 25 μL，上游引物Sprimer 1 μL，下游引物M4 1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL，混合均勻；擴(kuò)增程序：94℃，3 min；94℃，30 s，56℃，60 s，72℃，120 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min，4℃保存?zhèn)溆?，PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 病原鑒定

將檢測到有條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，得到的測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，鑒定病毒種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

文山州廣南縣西葫蘆出現(xiàn)葉片褪綠、畸形、蕨葉等癥狀，果實(shí)也出現(xiàn)褪綠、斑駁，表面不平整，形成凸起泡狀斑，如圖1所示。

2.2 電泳檢測及序列分析

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得大小約800 bp的明顯條帶（圖2），測序結(jié)果為887 bp。將測序得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，該病原序列與番木瓜環(huán)斑病毒Papaya ringspot virus （PRSV）（KY996464）基因序列同源性達(dá)87%。綜上，利用RTPCR檢測及序列同源性比對分析確定侵染西葫蘆的病毒是番木瓜環(huán)斑病毒。

3 討論

筆者在云南文山州廣南縣調(diào)查發(fā)現(xiàn)西葫蘆出現(xiàn)疑似病毒病感染的癥狀，對具有典型癥狀的病樣進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增檢測，將測序得到的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對分析，表明廣南縣西葫蘆表現(xiàn)褪綠、畸形、蕨葉、泡狀斑癥狀的病樣中含有番木瓜環(huán)斑病毒Papaya ringspot virus，這是文山州首次在西葫蘆上檢測到番木瓜環(huán)斑病毒。PRSV最早在美國報(bào)道，隨后日本、印度、澳大利亞、巴西等國家均有報(bào)道，在我國海南、臺(tái)灣、廣州、廣西、福建等地區(qū)也有報(bào)道。該病毒在云南普遍發(fā)生，昆明、玉溪、楚雄、紅河、臨滄、德宏、保山等地區(qū)均有報(bào)道[48]。葫蘆科作物作為世界重要食用植物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位，然而對于西葫蘆病毒病的報(bào)道相對較少，人們對病毒感染西葫蘆的癥狀識(shí)別、鑒定及防治上的了解存在一定的局限。西葫蘆一旦感染病毒病，其損失十分嚴(yán)重。PRSV是馬鈴薯Y病毒屬成員，除侵染番木瓜外，主要侵染葫蘆科植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失，因而如何有效開展防治工作成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)急需突破的關(guān)鍵。目前尚不清楚文山州廣南縣發(fā)生PRSV的傳染源、傳播途徑及寄主范圍，后期應(yīng)進(jìn)一步開展關(guān)于PRSV侵染、傳播、致病、寄主抗性等方面的研究，以指導(dǎo)抗病品種選育及構(gòu)建新種質(zhì)資源庫，為防治番木瓜環(huán)斑病毒病提出有效措施。

參考文獻(xiàn)

[1] 戚春章. 中國蔬菜種質(zhì)資源的種類和分布[J]. 作物品種資源， 1997（1）： 15.

[2] ZHAO M F， CHEN J， ZHENG H， et al. Molecular analysis of Zucchini yellow mosaic virus isolates from Hangzhou [J]. Journal of Phytopathology， 2003， 151（6）： 307311.

[3] CHEN J， CHEN J， ADAMS M J. A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae， and its use to examine the taxonomic status of several members of the family [J]. Archives of Virology， 2001， 146（4）：757766.

[4] 吳遵耀，郭林榕，熊月明.番木瓜生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2007（3）：8890.

[5] 饒雪琴，李華平.番木瓜環(huán)斑病毒融合基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（4）：325329.

[6] 蔡英卿，賴鐘雄.番木瓜生物技術(shù)研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（3）：429434.

[7] 李向東，李懷方，范在豐.馬鈴薯Y病毒屬病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，1999，26（4）：283285.

[8] 朱靜，譚冠林，包改麗，等.云南番木瓜環(huán)斑病毒的發(fā)生及遺傳多樣性[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41（6）：11421151.

（責(zé)任編輯：楊明麗）