李六英 王甲軍 張煒 陳美均 馬冠華 于慶濤 帥紅

摘 要：為了解我國煙草赤星病的2種主要致病菌鏈格孢菌Alternaria alternata和長柄鏈格孢菌Alternaria longipes的碳氮源代謝表型。采用Biolog表型芯片技術(shù)分析了2株鏈格孢菌（中等致病力的CQ1和GZ11）及2株長柄鏈格孢菌（強致病力的HuN2和弱致病力的YN4）對PM1、PM2微孔板中190種碳源物質(zhì)和PM3微孔板中95種氮源物質(zhì)的代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株赤星病菌均能代謝PM1-PM3微孔板中24.21%的碳源和86.31%的氮源。不同致病力菌株間的碳氮源代謝能力表現(xiàn)出一定差異，長柄鏈格孢菌的強致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4對D-甘露糖、D-木糖、D-甘露醇、b-環(huán)糊精、L-纈氨酸、D-天門冬酰胺、腺苷和i-赤蘚糖醇等物質(zhì)的代謝更顯著；鏈格孢菌的中等致病力菌株CQ1比GZ11對L-鼠李糖、海帶多糖和二羥基丙酮的代謝更好；弱致病力菌株YN4比強致病力菌株HuN2和中等致病力菌株CQ1、GZ11對水楊苷的代謝更明顯。表明煙草赤星病菌的不同種群菌株對碳氮源的代謝情況總體趨勢一致，但不同致病力菌株間存在一定差異。

關(guān)鍵詞：煙草赤星病菌；Biolog表型芯片技術(shù)；代謝表型

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）05-0079-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.011

Abstract： Tobacco brown spot is a fungal disease occurring at the late stage of tobacco maturation， which is mainly harmful to tobacco leaf and seriously affects tobacco production in China. In order to understand the carbon and nitrogen source utilization phenotypes of Alternaria alternata and Alternaria longipes which are two main pathogenic fungi of tobacco in China. CQ1 （moderately virulent） and GZ11 （moderately virulent） of A. alternata as well as HuN2 （most virulent） and YN4 （weak virulent） of A. longipes were selected to analyze the utilization of 190 species of carbon source materials in the microplates of PM1 and PM2， 95 species of nitrogen source of PM3 using the Phenotype Microarray System. The results revealed that the utilization of carbon and nitrogen sources of the four tested strains were roughly similar， the utilization ratio of carbon and nitrogen sources were 24.21% and 86.31%， respectively. There were also some differences among them， for A. longipes， the most virulent HuN2 had a better use of D-Mannose， D-Xylose， D-Mannitol， b-Cyclodextrin， L-Valine， D-Asparagine， L-Asparagin， Adenosine， i-Erythritol， and so on than the weak virulent YN4. For A. alternata， the moderately virulent CQ1 had a better ability in using L-Rhamnose， Laminarin and Dihydroxyacetone than GZ11. Additionally， the weak pathogenic strain YN4 was better than HuN2， CQ1 and GZ11 in using Salicin which indicated that there were obvious utilization variance in different types of pathogenicity.

Keywords： Alternaria alternata and Alternaria longipes； phenotype microarray system； metabolic phenotype analysis

煙草赤星病（Tobacco brown spot）是發(fā)生于煙株生長后期的真菌性病害，主要為害成熟葉片，近年來在我國造成的危害逐年加重，嚴重威脅各煙區(qū)的煙葉生產(chǎn)[1-3]。碳氮源是微生物生長過程中獲取能量關(guān)鍵的基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)[4]。病原菌能否正常生長甚至發(fā)展成優(yōu)勢致病菌，對碳氮源物質(zhì)良好的代謝能力是一個重要因素[5]。了解不同致病力種群病原菌的碳氮源代謝情況，能夠為研究病原菌的營養(yǎng)利用、環(huán)境適應(yīng)能力、與寄主植物互作以及致病機理提供理論信息[6]?？蔀獒槍π赃M行抗病品種選育及病害控制提供重要信息。

分析碳氮源物質(zhì)的利用情況是解釋微生物代謝表型的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的微生物碳氮源利用試驗是通過添加碳氮源物質(zhì)于培養(yǎng)基中進行測定[7]，測試物質(zhì)種類有限且操作繁瑣。Biolog表型芯片技術(shù)（Phenotype Microarray System，PMs）是一種測定微生物代謝活動的高通量技術(shù)，該技術(shù)能快捷地獲得微生物種群代謝碳氮源的大量數(shù)據(jù)，反映出微生物活性的豐富信息[8]。已有研究利用Biolog表型芯片技術(shù)分析了不同環(huán)境中復(fù)雜微生物的表型特性[9]、不同土壤樣品質(zhì)地[10]、野生型和突變型菌株的生物學(xué)特性[11]，以及輔助基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究基因改變后生物的表現(xiàn)型和功能變化[12]。

目前，關(guān)于煙草赤星病菌在病原鑒定[13]、藥劑篩選[14]和烤煙新品種選育[15-17]等方面研究較多。而在表型組學(xué)分析方面，只有WANG等[18] 報道了1株鏈格孢菌（Alternaria alternata）對20塊PM微孔板中各類物質(zhì)的代謝情況。為了解赤星病的2種主要致病菌鏈格孢菌（A. alternata）和長柄鏈格孢菌（A. longipes）種群中不同致病力菌株的碳氮源代謝表型，本研究采用Biolog表型芯片技術(shù)測定了2株鏈格孢菌和2株長柄鏈格孢菌的不同致病力菌株對190種碳源物質(zhì)和95種氮源物質(zhì)的代謝情況， 以期為進一步了解赤星病菌的代謝機制和選育抗赤星病煙草品種提供理論信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：鏈格孢菌（Alternaria alternata）種群的中等致病力菌株CQ1和GZ11與長柄鏈格孢菌（A. longipes）種群的強致病力菌株HuN2和弱致病力菌株YN4，由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所提供。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉17 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。

試驗器材：PM1、PM2和PM3微孔板（貨號：#12111、#12112、#12121），F(xiàn)F-IF接種液（#72106），V型加樣槽（#3002），美國Biolog公司。

供試藥劑：D-葡萄糖（#G5400），硫酸鈉（#S9627），磷酸二氫鉀（#P53276），Sigma公司。

主要儀器設(shè)備：OmniLog PM系統(tǒng)（#71000），8通道電動移液器（#3710）和濁度計（#3531），美國Biolog公司。

試驗時間及地點：本研究于2018年1—3月在西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草赤星病菌對PM碳氮源代謝的測定 參照WANG等[18]的方法并加以改進。將供試菌株于PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d，用少量無菌蒸餾水洗下分生孢子，無菌雙層紗布過濾，再加無菌蒸餾水將孢子懸浮液稀釋到1×105個/mL。用FF-IF接種液調(diào)整孢子懸浮液濃度，使其透光度為62% T（T為Biolog標準濃度單位）。迅速將配制好的菌懸液倒入V型槽中，用電動移液器將孢子懸浮液分別接種至PM1、PM2微孔板中，每孔100 μL；加入PM3板前，需往62% T孢子懸浮液中加入D-葡萄糖、磷酸二氫鉀和硫酸鈉，使其在孢子懸浮液中的終濃度分別為100 mmol/L、5 mmol/L和2 mmol/L，再將此孢子懸浮液移至PM3板微孔中，每孔100 μL。PM1、PM2和PM3板置于Biolog系統(tǒng)培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d，設(shè)置OmniLog軟件，由OmniLog 2.4系統(tǒng)每15 min讀數(shù)一次。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理與分析 利用Biolog D5E_OKA_ data.exe軟件收集各菌株的代謝表型數(shù)據(jù)，并用Biolog OL_FM_1.2.exe軟件進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。對相同PM板，2株病原菌的代謝動力學(xué)曲線分別用紅色和黃色標記，采用Biolog OL_PR_1.2.exe軟件將兩組數(shù)據(jù)進行對比分析，選擇峰面積（Aera）為對比參數(shù)，Aera越大，表明菌株對被檢測營養(yǎng)物質(zhì)的代謝越強，共同代謝的區(qū)域標記為黃色；根據(jù)代謝孔顏色面積的大小分析2株菌株的代謝表型差異。

2 結(jié) 果

2.1 煙草赤星病菌對PM1和PM2中碳源代謝表型分析

通過代謝表型組學(xué)分析，獲得4株煙草赤星病菌（CQ1、GZ11、HuN2和YN4）對190種碳源代謝表型信息。4株赤星病菌均能夠代謝PM1微孔板中包括糖類、核苷酸、羧酸類等95種碳源物質(zhì)中的25種物質(zhì)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)，利用率達26.31%（圖1）。高效代謝的碳源有13種，包括L-阿拉伯糖（PM1，A02）、D-甘露糖（PM1，A11）、D-山梨醇（PM1，B02）、D-木糖（PM1，B08）、D-甘露醇（PM1，B11）、D-核糖（PM1，C04）、L-鼠李糖（PM1，C06）、a-D-乳糖（PM1，D09）和果糖（PM1，D10）等（表1）。各菌株碳源代謝產(chǎn)生的動力學(xué)曲線疊加分析表明，4株病菌的碳源代謝圖譜基本一致。但是長柄鏈格孢種群的強致病力菌株HuN2對D-甘露糖（PM1，A11）、D-木糖（PM1，B08）和尿苷（PM1，D11）等的代謝效率較弱致病力菌株YN4強；鏈格孢種群的中等致病力菌株CQ1、GZ11對25種物質(zhì)的代謝能力相當，只有CQ1對L-鼠李糖（PM1，C06）比GZ11的代謝更強（圖1）。

4株菌株均能代謝PM2微孔板中95種碳源物質(zhì)中的b-環(huán)糊精（PM2，A04）、海帶多糖（PM2，A10）和D-阿拉伯糖醇（PM2，B06）等21種，利用率為22.11%，而不能利用硫酸軟骨素C（PM2，A02）等74種物質(zhì)。在能夠代謝的21種碳源物質(zhì)中，強致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4對b-環(huán)糊精（PM2，A04）、g-環(huán)糊精（PM2，A05）、i-赤蘚糖醇（PM2，B10）和奎尼酸（PM2，F(xiàn)06）等的代謝更好；而弱致病力菌株YN4對水楊苷（PM2，D02）的代謝比強致病力菌株HuN2以及中等致病力菌株CQ1、GZ11都明顯更好；中等致病力菌株CQ1、GZ11對21種碳源物質(zhì)的代謝能力基本一致，只有CQ1對海帶多糖（PM2，A10）和二羥基丙酮（PM2，H09）比GZ11代謝更強（圖1）。

2.2 煙草赤星病菌對PM3中氮源代謝表型分析

通過分析4株煙草赤星病菌對PM3中95種氮源代謝表型信息發(fā)現(xiàn)，4株赤星病菌均能利用PM3中的縮二脲（PM3，A06）、L-纈氨酸（PM3，C02）和腐胺（PM3，D11）等82種氮源物質(zhì)而產(chǎn)生顏色反應(yīng)，代謝率達86.31%，明顯高于其對PM1、PM2中碳源物質(zhì)的代謝。4株病原菌對PM3氮源代謝指紋圖譜基本相似，能夠利用的物質(zhì)種類基本一致，

但是不同菌株間代謝程度也存在一定差異。中等致病力菌株CQ1與GZ11利用程度相似性較高，動力曲線圖形重合度也較高，而強致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4對D-天門冬酰胺（PM3，C04）、L-纈氨酸（PM3，C04）、L-鳥氨酸（PM3，C12）和腺苷（PM3，F(xiàn)03）等的代謝明顯較強（圖1）。

3 討 論

一種病原菌能否成為優(yōu)勢群體的關(guān)鍵是環(huán)境適應(yīng)能力，而評價環(huán)境適應(yīng)能力最直觀的是表型變化。Biolog表型芯片技術(shù)具有高通量、速度快、準確性高、能動態(tài)反應(yīng)微生物細胞代謝的生化過程等優(yōu)點，在國外已被廣泛應(yīng)用于微生物領(lǐng)域的研究[19-21]。

同時，已有研究表明，葡萄糖、果糖、蔗糖等和部分氨基酸等碳源對微生物的生長是必須的。本研究對煙草赤星病的主要致病菌中鏈格孢和長柄鏈格孢的不同致病力代表菌株（CQ1、GZ11、HuN2和YN4）比較分析發(fā)現(xiàn)，4株煙草赤星病菌對PM1、PM2中190種碳源物質(zhì)以及PM3中95種氮源物質(zhì)的代謝圖譜總體趨勢基本一致，碳源利用率為24.21%，氮源利用率為86.31%。這一結(jié)果與WANG等[21]采用PMs研究的1株貴州煙草赤星病菌對PM1-PM3中碳氮源代謝率相近，其代謝率分別為24.74%和85.26%。不過，赤星病原菌群體在碳氮源的種類利用上是否具有相似性還需測試更多菌株進行分析。

4株煙草赤星病菌對供試碳氮源代謝率總體上表現(xiàn)出相似性，但是不同致病力菌株的代謝能力呈現(xiàn)出一些差異。強致病力菌株HuN2比弱致病力菌株YN4對D-甘露糖（PM1，A11）、D-木糖（PM1，B08）、b-環(huán)糊精（PM2，A04）和腺苷（PM3，F(xiàn)03）等的代謝程度更高；中等致病力菌株CQ1比GZ11對少許物質(zhì)L-鼠李糖（PM1，C06）、海帶多糖（PM2，A10）和二羥基丙酮（PM2，H09）代謝明顯更強；弱致病力菌株YN4對水楊苷（PM2，D02）的代謝比強致病力菌株HuN2以及中等致病力菌株CQ1、GZ11都明顯更強，表明煙草赤星病菌個體間存在

一定的代謝表型差異。表型是生物遺傳基礎(chǔ)的外在表現(xiàn)，本研究前期分析發(fā)現(xiàn)煙草赤星病菌具有豐富的遺傳多樣性（另文發(fā)表），這也進一步證實赤星病菌遺傳多樣性與種群內(nèi)代謝表型和致病力差異相關(guān)。

已有研究發(fā)現(xiàn)，不同碳水化合物分別調(diào)控植物葉片的生長發(fā)育[22]、乙烯的形成等[23]，有的生化代謝只存在于葉片表面[24]，有的僅發(fā)生在葉片成熟過程中[25]。而赤星病菌基本不侵染幼嫩葉片而是在成熟期侵染為害[26]。本研究發(fā)現(xiàn)赤星病菌（A. alternata，A. longipes）可以利用大部分氮源（86.31%），而較少種類的碳源能夠被其代謝（24.21%）。碳源是微生物生命活動中的重要元素，成熟煙葉內(nèi)化學(xué)成分或表面分泌物可能含有某些特有的碳源，這些碳源有利于赤星病菌的生長和繁殖，從而導(dǎo)致赤星病的發(fā)生與為害。不同品種之間的抗赤星病能力差異[27]是否與D-甘露糖、D-木糖、L-鼠李糖、水楊苷等物質(zhì)在不同煙草品種中的含量有關(guān)還有待于進一步深入研究。

4 結(jié) 論

通過Biolog表型芯片技術(shù)測定了4株煙草赤星病菌對190種碳源物質(zhì)以及95種氮源物質(zhì)的代謝情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株菌株對PM1、PM2及PM3微孔板的碳氮源物質(zhì)代謝總體上一致，碳源利用率為24.21%，氮源利用率86.31%。但是強致病力菌株對部分碳源物質(zhì)的代謝相對中等致病力菌株以及弱致病力菌株更強，弱致病力菌株對個別物質(zhì)的利用程度較中等和強致病力菌株更好。本文獲得的赤星病菌的代謝表型組學(xué)信息有助于了解煙草赤星病菌不同致病力菌株與煙株互作過程中病原菌的碳氮源代謝情況，為煙草抗赤星病品種的選育提供了理論信息。今后有待于深入研究不同生長時期煙株內(nèi)碳氮源物質(zhì)種類和含量情況，明確其與赤星病菌侵染和為害的關(guān)系以及赤星病菌對碳氮源的代謝機制。

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