低溫脅迫下煙苗多酚代謝及其抗氧化能力分析

周培祿 劉光亮 王樹聲 李琦瑤 許娜 王程棟 楊銀菊 曾文龍 陳愛國

摘 要：為了明確在低溫脅迫條件下煙苗中多酚物質(zhì)代謝與抗氧化能力的關(guān)系，本研究以煙草K326為材料，對比分析了低溫脅迫處理（4 ℃）和對照處理（25 ℃）煙苗葉片中多酚物質(zhì)含量及其代謝酶活性和基因表達(dá)水平變化與植物抗氧化酶活性的關(guān)系。結(jié)果表明，低溫脅迫處理后，煙草葉片萎蔫、細(xì)胞膜損傷嚴(yán)重，相對電導(dǎo)率升高；總酚含量受低溫脅迫影響較小，木質(zhì)素含量顯著增加（p<0.05）；低溫處理后，SOD活性顯著升高（p<0.05），CAT活性和總抗氧化能力（T-AOC）均低于對照；PAL、HCT和POD酶活性均升高，PAL、HCT和POD基因表達(dá)水平均上調(diào)。以上結(jié)果表明，低溫脅迫促進(jìn)煙苗多酚代謝中木質(zhì)素合成，通過提高木質(zhì)素含量增強(qiáng)細(xì)胞壁的保護(hù)作用是植物抵御環(huán)境脅迫的重要機(jī)制。

關(guān)鍵詞：煙草；低溫脅迫；木質(zhì)素；多酚代謝；抗氧化能力

中圖分類號：S572.01 文章編號：1007-5119（2018）05-0033-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.005

Abstract： In order to study the relationship between metabolism of polyphenols and the antioxidant capacity of tobacco seedlings under cold stress， 7th-leaf stage tobacco seedlings of K326 were used to measure the physiological indicators of tobacco seedlings at chilling stress （4 ℃）， the changes of polyphenol contents， metabolism related enzyme activities， and gene expression were detected during the stresses of chilling. The results showed that after the treatment of chilling stress， leaf wilting， cell membrane damage and relative electrolytic leakage of tobacco increased， while total polyphenol content was less affected by low temperature stress， and lignin content increased significantly （p<0.05）. The activity of superoxide dismutase （SOD） was significantly increased （p<0.05）， the activity of catalase （CAT） and total antioxidant capacity （T-AOC） decreased and lower than control treatment. PAL， HCT and POD enzyme activities were increased and the expression levels of PAL， HCT and POD genes were all increased under chilling stress. The above results indicated that the metabolism of polyphenols shifted to the downstream biosynthesis of lignin， and enhancing the hardness of cell walls by increasing lignin content might be an important factor for plants to improve their cold resistance.

Keywords： tobacco； cold stress； lignin； polyphenol metabolism； antioxidant capacity

低溫冷害是作物栽培中常常遇到的一種自然災(zāi)害，是很多地區(qū)限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素[1]。在我國南方煙區(qū)早春季節(jié)常會受“倒春寒”的危害[2-3]，嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量[4]。前人研究表明，低溫脅迫植物誘導(dǎo)活性氧（ROS）的積累，破壞重要細(xì)胞化合物如DNA和RNA結(jié)構(gòu)，造成蛋白質(zhì)氧化和膜脂過氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[5]。早期研究認(rèn)為，在遭受低溫、光照輻射等脅迫時植物通過增加合成抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等清除過多ROS[6-7]，從而保護(hù)細(xì)胞的正常功能。

研究表明多酚物質(zhì)合成是植物應(yīng)對環(huán)境脅迫的另一重要的途徑[8]。酚類化合物在植物中廣泛存在，主要來源于苯丙烷代謝途徑[9]。植物一方面通過調(diào)控酚類化合物的含量與組成抑制氧自由基的產(chǎn)生，保護(hù)光系統(tǒng)及細(xì)胞膜完整性[10-11]，同時通過改變木質(zhì)素的含量和組成結(jié)構(gòu)提高細(xì)胞壁強(qiáng)度[12]，增強(qiáng)植物低溫耐性[13]。低溫條件下，通過專一性酶抑制劑抑制ROS的產(chǎn)生，多酚合成關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、肉桂酸羥化酶（Cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-Coumarate：coenzyme A ligase，4CL）活性和基因表達(dá)量降低，多酚含量降低，而通過ROS激活劑處理則得出相反的結(jié)果[14]，從而推測植物體內(nèi)ROS作為信號分子響應(yīng)環(huán)境脅迫促進(jìn)酚類化合物的合成[15]。

本實驗選用對低溫敏感且在我國廣泛種植的烤煙品種K326為試驗材料，應(yīng)用人工智能氣候箱進(jìn)行低溫脅迫處理，通過對相關(guān)指標(biāo)的測定，分析煙苗在低溫脅迫下多酚物質(zhì)代謝變化與植物抗氧化能力的關(guān)系，了解多酚物質(zhì)在植物抵御環(huán)境脅迫中的關(guān)鍵作用，以推進(jìn)增強(qiáng)煙草幼苗低溫耐性的研究，為提高煙葉產(chǎn)量與質(zhì)量及解決煙苗低溫傷害難題提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和低溫處理

煙草（Nicotiana tabacum， cv. K326）幼苗在人工智能氣候箱（DPGX-350B，寧波普朗特儀器有限公司，浙江）培養(yǎng)至7葉，培養(yǎng)條件為溫度：（25±2） ℃，相對濕度65%～75%，光照周期時間為14 h照光/10 h黑暗。然后分別在25 ℃（CK）和4 ℃（T）條件下分別培養(yǎng)，0、6、12、18、24和36 h后取倒數(shù)第2片展開葉作為后續(xù)試驗材料，取樣3株混勻作為一個樣品，共3個重復(fù)。取樣后樣品迅速用液氮處理后放于?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總酚和木質(zhì)素含量測定

多酚含量檢測：取2 g鮮樣（粉碎），浸泡在10 mL 含70%乙醇、1%鹽酸（體積分?jǐn)?shù)）的溶液中2 h，然后4 ℃條件離心20 min（10 000×g），取上清液稀釋至25 mL備用。總酚含量用Folin-Ciocalteu（福林-西奧卡特）法測定[16]。木質(zhì)素含量根據(jù)木質(zhì)素含量測定試劑盒（Cominbio， suzhou， China）方法進(jìn)行檢測。

1.3 相對電導(dǎo)率和MDA含量測定

相對電導(dǎo)率（REC）測定根據(jù)YANG等[17]和WAHID等[18]方法。10片新鮮葉圓片（0.5 cm2）置于燒杯加入20 mL蒸餾水并抽真空30 min，震蕩3 h后測定初試電導(dǎo)率（S1）。然后將有葉圓片和蒸餾水的燒杯煮沸30 min，冷卻至室溫后測定最終電導(dǎo)率（S2）。以蒸餾水作為對照測定電導(dǎo)率（S0）。相對電導(dǎo)率（REC）的計算是樣品被高溫殺死前后電導(dǎo)率的百分比，表示為：REC（%）=[（S1-S0）/（S2-S0）]×100。丙二醛（MDA）含量測定根據(jù)CUI等[19]的方法。

1.4 抗氧化體系檢測

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定根據(jù)NBT法測定[20]。過氧化物酶（POD）活性通過測定愈創(chuàng)木酚因氧化反應(yīng)引起在470 nm處吸光度的變化[21]。過氧化氫酶（CAT）活性測定參照文獻(xiàn)[22]?？偪寡趸芰Γ═-AOC）測定根據(jù)南京建成生物工程研究所購買的試劑盒說明書方法，單位為U/g鮮質(zhì)量。

1.5 多酚代謝關(guān)鍵酶活性測定

采用紫外分光光度法利用PAL活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性。采用HCT活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定莽草酸酯羥基肉桂酸轉(zhuǎn)移酶（Shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase，HCT）活性，采用POD活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性。

1.6 引物設(shè)計及表達(dá)量測定

根據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計的要求，采用Primer

5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計（表1）。以Actin為內(nèi)參基因[23]，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因相對定量分析[24]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 20軟件進(jìn)行LSD多重比較法方差分析（p<0.05），Microsoft Excel 2013制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 低溫脅迫對煙苗形態(tài)和相對電導(dǎo)率的影響

為了探究低溫脅迫對煙苗生長發(fā)育的影響，比較了4 ℃（T）低溫處理和25 ℃（CK）對照處理形態(tài)學(xué)差異變化。結(jié)果表明（圖1），一定時間的低溫脅迫會引起煙苗葉片的萎蔫，萎蔫程度隨著脅迫時間的增加而加強(qiáng)。另外，相對電導(dǎo)率（REC）測定結(jié)果表明（圖2），低溫處理后葉片REC升高，并在12 h開始低溫處理與對照之間差異達(dá)到顯著水平（p<0.05），在24 h時達(dá)到最高值。

2.2 低溫脅迫對煙苗抗氧化能力的影響

由圖3可知，低溫脅迫處理后煙苗葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著升高，脅迫6 h時差異達(dá)到顯著水平（p<0.05），持續(xù)低溫脅迫處理，SOD活性維持在相對較高的水平。過氧化氫酶（CAT）活性和總抗氧化能力（T-AOC）在低溫脅迫處理后下降，并在12 h降至最低值，繼續(xù)低溫脅迫則表現(xiàn)出上升的趨勢，但仍低于對照處理。

2.3 低溫脅迫對煙苗總酚和木質(zhì)素含量的影響

由圖4可知，煙苗葉片中總酚含量在低溫處理后下降，但無顯著的差異。在煙苗葉片中木質(zhì)素含量在低溫脅迫處理后升高，其中6 h低溫脅迫處理后差異即達(dá)到顯著水平（p<0.05），低溫脅迫處理較對照處理高46%，在脅迫處理12 h后木質(zhì)素含量持續(xù)增加，表明多酚物質(zhì)的合成與降解在低溫脅迫下存在動態(tài)平衡，上游代謝物質(zhì)可能向下游木質(zhì)素合成轉(zhuǎn)移。

2.4 低溫脅迫對煙苗多酚代謝關(guān)鍵酶活性的影響

由圖5可知，低溫處理后煙苗中PAL活性先升高后降低，低溫處理12 h時PAL活性最高為33.0 U/g鮮質(zhì)量，顯著的高于對照處理的27.1 U/g鮮質(zhì)量；隨著低溫脅迫時間的增加，PAL活性降低。低溫脅迫條件下，苗期煙葉中HCT活性與PAL活性變化規(guī)律相同，12 h低溫脅迫處理時活性最高分別為32.2和33.0 U/g鮮質(zhì)量。然而，低溫脅迫處理后煙苗葉片中POD活性呈增加趨勢，在12和24 h分別增加17.4%和9.8%。

2.5 低溫脅迫對煙苗多酚代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖6可知，低溫脅迫條件下煙苗葉片中多酚代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)量均有不同程度的提高，但不同基因之間變化規(guī)律存在差異。PAL1、PAL2、PAL3和PAL4是編碼PAL酶的同源基因，在低溫條件下均顯著地上調(diào)表達(dá)，除PAL1低溫處理后表達(dá)量持續(xù)增加外，PAL 2、PAL 3和PAL 4三個基因在低溫處理12 h時達(dá)到最高值，24 h低溫處理后表達(dá)量下降，但仍顯著地高于對照處理。HCT基因在低溫條件下表達(dá)水平顯著提高，其中12和24 h提高了6.6和1.7倍。POD基因表達(dá)量在低溫脅迫條件下顯著增加，12和24 h分別增加了1.4和1.2倍。

3 討 論

低溫、干旱和光照輻射等環(huán)境脅迫均會誘導(dǎo)植物體內(nèi)多種多酚物質(zhì)的代謝變化[25-27]，在植物抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮著重要的作用[28]。多酚物質(zhì)合成下游產(chǎn)物木質(zhì)素是細(xì)胞壁的重要組成部分，可以提高植物對生物和非生物脅迫的抗性，為植物提供機(jī)械支持，木質(zhì)素含量下降使植物在環(huán)境脅迫時更加脆弱[29-30]。因此，環(huán)境脅迫時木質(zhì)素含量的變化是判斷植物抵御環(huán)境脅迫的重要指標(biāo)。在本研究中，低溫脅迫處理后植物總酚含量少量下降，而木質(zhì)素含量顯著地增加，因此推測，木質(zhì)素作為多酚物質(zhì)代謝的下游產(chǎn)物，在低溫脅迫條件下多酚物質(zhì)降解向木質(zhì)素合成方向轉(zhuǎn)移，在環(huán)境脅迫存在時起到保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的重要作用。

BARCEL等[31]研究報道了植物中過氧化物酶活性與細(xì)胞壁硬化有直接的關(guān)系。后來研究表明，在木質(zhì)素合成過程中，低溫脅迫時H2O2含量水平和POD活性升高共同促進(jìn)木質(zhì)素含量的增加[33]。在本研究中，在低溫脅迫前期（12 h之前）總抗氧化能力（T-AOC）下降，不能及時清除過多的H2O2，造成H2O2積累和含量水平的增加，促進(jìn)了多酚物質(zhì)在POD酶的作用下合成木質(zhì)素以及低溫脅迫后期抗氧化能力的升高。因此，在低溫脅迫條件下煙苗中木質(zhì)素合成過程可能會與抗氧化酶共同清除低溫脅迫產(chǎn)生的氧化脅迫物質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)植株的低溫抗性。

木質(zhì)素的合成通過一系列的酶參與，其中包括關(guān)鍵酶PAL、HCT和POD等。PAL是苯丙烷代謝途徑中調(diào)控多酚類物質(zhì)生物合成的第一個酶，也是酚類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶和限速酶[32]。在本研究中，低溫脅迫條件下PAL的上調(diào)表達(dá)和PAL活性的升高表明，低溫脅迫可以快速促進(jìn)多酚物質(zhì)的合成，促進(jìn)苯丙烷代謝途徑中間代謝產(chǎn)物的增加。HCT是木質(zhì)素生物合成途徑的一個上游基因，在木質(zhì)素前體松柏醇和芥子醇合成中扮演著重要的角色，通過其表達(dá)修飾可能會改變木質(zhì)素含量的變化[33]。木質(zhì)素的合成是在POD和其他氧化聚合酶在H2O2存在時催化木質(zhì)素前體聚合的過程[34]。因此，低溫脅迫條件下上游基因PAL和HCT基因表達(dá)水平上調(diào)和其酶活性升高促進(jìn)多酚物質(zhì)的合成，并在下游POD基因表達(dá)水平上調(diào)和其酶活性升高的作用下促進(jìn)多酚物質(zhì)的降解和木質(zhì)素的合成，最終多酚物質(zhì)流向木質(zhì)素的生物合成。

4. 結(jié) 論

在低溫脅迫條件下煙苗中木質(zhì)素的合成代謝在抵御環(huán)境脅迫中起到重要的作用；低溫脅迫條件下PAL、HCT和POD基因表達(dá)水平上調(diào)和其酶活性升高促進(jìn)多酚代謝增加木質(zhì)素合成，通過提高木質(zhì)素含量增強(qiáng)細(xì)胞壁的保護(hù)作用是植物抵御環(huán)境脅迫的重要機(jī)制；同時木質(zhì)素的合成與SOD、POD等抗氧化酶在清除因脅迫產(chǎn)生的H2O2中扮演著重要的角色。

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