楊光 羅建平 王瑛

摘要 [目的]研究外源多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生與過氧化氫（H2O2）代謝酶活性的關(guān)系。[方法]主要測定了外源多胺處理后H2O2的動(dòng)態(tài)變化和代謝酶的活性。[結(jié)果]外源多胺在有效促進(jìn)芽發(fā)生的同時(shí)也能顯著提高培養(yǎng)物中H2O2的含量，2.0 mmol/L亞精胺（Spd）或腐胺（Put）處理5 d的培養(yǎng)物中H2O2含量分別比對照組高175.6%和180.6%，添加H2O2淬滅劑二甲基硫脲（DMTU）可抑制類原球莖芽的發(fā)生，補(bǔ)充Spd或Put可部分解除DMTU的抑制作用。在外源多胺處理前期和中期，雖然超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性無明顯改變，但合成H2O2的多胺氧化酶（PAO）活性和分解H2O2的抗壞血酸過氧化物酶（APX）與過氧化氫酶（CAT）活性明顯增加。[結(jié)論]外源多胺作用的霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生與H2O2積累和分解代謝有關(guān)。

關(guān)鍵詞 霍山石斛；外源多胺；類原球莖；芽發(fā)生；代謝酶

中圖分類號(hào) S567.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào) 0517-6611（2018）01-0001-04

Abstract [Objective] The research aimed to study the relationship between enhanced conversion of protocorm-like bodies （PLBs） of Dendrobium huoshanense to shoots by exogenous polyamines （PAs） and H2O2-metabolizing enzyme activities.[Method]We mainly measured the dynamic changes of H2O2 and the activities of metabolizing enzyme after exogenous polyamines treatment.[Result]Exogenous addition of PAs not only promoted the conversion frequency of PLBs to shoots but also elevated the levels of H2O2，compared with the control， the H2O2 levels in PAs groups increased by 175.6% （Spd） and 180.6% （Put） on the 5th day after being treated using 2.0 mmol/L Spd or Put for 5 days.Dimethylthiourea （DMTU）， the scavenger of H2O2， inhibited conversion of PLBs to shoots and the effect could be offset partly by exogenous PAs.Although the activities of superoxide dismutase （SOD） and peroxidase （POD） did not change significantly in the early and middle stages of exogenous polyamine treatment，the activity of polyamine oxidase （PAO） for synthesizing H2O2，ascorbate peroxidase （APX） for dissolving H2O2 and catalase （CAT） were significantly increased. [Conclusion]The occurrence of protocorm buds of Dendrobium huoshanense with the action of exogenous polyamines is related to the accumulation and catabolism of H2O2.

Key words Dendrobium huoshanense； Exogenous polyamines；Protocorm-like bodies；Shoot morphogenesis；Metabolizing enzymes

多胺是生物體內(nèi)廣泛存在的一類具有生物活性的物質(zhì)，它作為信號(hào)分子參與了植物胚胎形成、根和芽發(fā)生、花發(fā)育、果實(shí)成熟及衰老等生長發(fā)育過程，對植物的形態(tài)發(fā)生具有促進(jìn)作用[1]。過氧化氫（H2O2）被認(rèn)為是植物體內(nèi)產(chǎn)生的最穩(wěn)定的活性氧分子，現(xiàn)有研究認(rèn)為它的積累與分解誘發(fā)了調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的改變，是影響植物生長發(fā)育的一種重要的胞內(nèi)分子[2]。鑒于多胺可以通過多胺氧化酶（PAO）生成H2O2導(dǎo)致胞內(nèi)H2O2積累并觸發(fā)相關(guān)代謝酶分解H2O2[3-4]，推測多胺促進(jìn)的植物形態(tài)發(fā)生可能與多胺代謝過程中H2O2的積累和分解相關(guān)。

霍山石斛（Dendrobium huoshanense C.Z.J.cheng）是特產(chǎn)于安徽霍山的名貴瀕危中藥材，屬蘭科石斛屬，具有滋陰、清熱、生津、潤肺、止咳、明目等功效[5-6]?；羯绞F(xiàn)已成功人工栽培，其種苗均是來自種子經(jīng)類原球莖形態(tài)發(fā)生所形成的試管苗。筆者將從芽發(fā)生過程中H2O2代謝變化的角度探討多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽高效發(fā)生的生理生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 霍山石斛類原球莖由合肥工業(yè)大學(xué)中草藥與功能食品研究所提供，傳代培養(yǎng)基為添加0.5 mg/mL NAA和0.5 mg/mL KT的固體MS培養(yǎng)基[7]。類原球莖（PLBs）每35 d傳代培養(yǎng)1次。取類原球莖轉(zhuǎn)接于無外源激素的固體MS培養(yǎng)基，在培養(yǎng)溫度（25±2）℃、光照時(shí)間16 h/d、相對濕度80%、光照強(qiáng)度30 μmol/（m2·s）條件下預(yù)培養(yǎng)30 d作為試驗(yàn)材料。

1.2 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的影響 將經(jīng)預(yù)培養(yǎng)的類原球莖分別接種于添加2.0 mmol/L亞精胺（Spd）、2.0 mmol/L腐胺（Put），以及5.0 mmol/L過氧化氫淬滅劑二甲基硫脲（DMTU）和Spd（2.0 mmol/L）或Put（2.0 mmol/L）組合的無植物激素固體MS培養(yǎng)基上為處理組，以不添加多胺和DMTU為對照，在培養(yǎng)溫度（25±2）℃、相對濕度80%、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度50 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)30和60 d時(shí)觀察并統(tǒng)計(jì)芽的發(fā)生情況。芽發(fā)生頻率以1 g類原球莖中產(chǎn)生的芽的個(gè)數(shù)表示。

1.3 H2O2含量的測定

根據(jù)Jincya等[8]的方法，通過監(jiān)測過氧化物-Ti復(fù)合物在410 nm的吸光度測定培養(yǎng)物中H2O2水平，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2的濃度。

1.4 H2O2代謝相關(guān)酶活性的測定

多胺氧化酶（PAO）活性的測定參照汪耀富等[9]方法進(jìn)行檢測；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Gupta等[10]和魯萍等[11]的方法，測定SOD在光下抑制氮藍(lán)四唑（NBT）的還原作用，以抑制NBT光化學(xué)還原50%為1個(gè)酶活單位；過氧化氫酶（CAT）活性測定參照Ayvaz等[12]的方法，在反應(yīng)體系中加入50 mmol/L pH 7.0 的磷酸緩沖液、0.1 mL 3%過氧化氫和適量酶液啟動(dòng)反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)開始后迅速測定波長240 nm處吸光度的下降速率，以1 min 1 mg蛋白分解1 μmol H2O2 為1個(gè)酶活力單位；過氧化物酶（POD）活性的測定參照Saidi等[13]的方法，用酶液啟動(dòng)反應(yīng)并以0.25%愈創(chuàng)木酚和0.75%過氧化氫為底物，測定470 nm處吸光度的上升速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 愈創(chuàng)木酚為1個(gè)酶活單位；抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定參照Saidi等[13]的方法，稱取0.5 g冰凍材料，研磨后于冰上加入5 mL提取緩沖液混勻提取，提取液4 ℃下離心取上清液，在25 ℃下直接測定波長290 nm處由于抗壞血酸氧化而引起吸光度的下降速率，以1 mg蛋白1 min氧化1 μmol 抗壞血酸為1個(gè)酶活單位。所有提取液的可溶性蛋白質(zhì)含量按Mollavali等[14]方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 試驗(yàn)中所有處理均為隨機(jī)處理，且做5～10個(gè)平行并重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采用均值± SE表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算其顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的影響

從表1可以看出，在培養(yǎng)30 d時(shí)，添加2.0 mmol/L Spd或Put的MS培養(yǎng)基中，霍山石斛類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是對照組的3.7 倍（Spd）和3.6倍（Put）；培養(yǎng)60 d時(shí)，多胺組芽發(fā)生總數(shù)分別是對照組的3.4 倍（Spd）和3.2 倍（Put），且多胺組大于5 mm的芽在30 d時(shí)分別占各自芽總數(shù)的23.3%和26.9%、在60 d時(shí)分別占各自芽總數(shù)的13.4%和16.3%，而對照組在30 d時(shí)無大于5 mm的芽、在60 d時(shí)占芽總數(shù)的18.0%，說明外源Spd或Put不僅能顯著促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生，在早期也能有效促進(jìn)新生芽的生長。

進(jìn)一步通過加入過氧化氫淬滅劑DMTU對外源多胺作用下H2O2水平與霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，當(dāng)類原球莖在僅加入DMTU的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后，每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)顯著降低，為對照組的44.7%，培養(yǎng)60 d時(shí)芽發(fā)生總數(shù)為對照組的35.8%，DMTU抑制芽發(fā)生的作用更為明顯（表1、2）；當(dāng)類原球莖在同時(shí)加入多胺和DMTU的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，多胺促進(jìn)的芽發(fā)生效應(yīng)被顯著抑制，培養(yǎng)30 d時(shí)每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是僅添加Spd和Put的24.6%和22.8%且無大于5mm的芽，在培養(yǎng)60 d時(shí)每克類原球莖芽發(fā)生總數(shù)分別是僅添加Spd和Put的28.4%和24.5%，說明類原球莖培養(yǎng)早期H2O2含量的升高為芽發(fā)生所必須，H2O2參與了多胺促進(jìn)的霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生。

2.2 外源多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2含量的動(dòng)態(tài)變化

為探求H2O2 與霍山石斛類原球莖芽的發(fā)生是否存在關(guān)聯(lián)性，試驗(yàn)測定了外源多胺作用對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程H2O2水平的影響。從圖1 可以看出，無多胺存在的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物中H2O2 的含量從培養(yǎng)開始急劇上升，在第5天時(shí)達(dá)到高峰隨后下降，并保持在一個(gè)較低的水平；在多胺組中，培養(yǎng)第5天的培養(yǎng)物中H2O2含量可高達(dá)對照組的175.6%（Spd）和180.6%（Put），并在培養(yǎng)第40天后與對照組H2O2含量接近，說明外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生早期H2O2積累的誘導(dǎo)作用明顯，提示多胺促進(jìn)的霍山石斛類原球莖芽發(fā)生與H2O2水平存在關(guān)聯(lián)。

2.3 外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2代謝酶活性的影響

2.3.1 PAO 活性。

PAO能催化多胺氧化降解產(chǎn)生H2O2，通過分析外源多胺作用下類原球莖芽發(fā)生過程中引起的PAO 活性變化，可揭示PAO 活性變化、H2O2的產(chǎn)生與芽發(fā)生三者之間的相互關(guān)系。從圖2可看出，霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中，對照組和多胺組中PAO 活性變化趨勢相一致，在初期急劇上升，在第5天出現(xiàn)高峰，隨后迅速下降后趨于平緩。添加外源多胺能顯著提高PAO的活性，并一直維持在較高水平，多胺組在培養(yǎng)第5天時(shí)PAO活性分別是對照組的21.2%（Spd）和14.9%（Put），說明外源多胺明顯地促進(jìn)了PAO活性。PAO的活性變化與芽發(fā)生過程中H2O2積累的變化（圖1）相一致，揭示霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中H2O2的積累可能與外源多胺誘導(dǎo)的PAO活性變化有關(guān)。

2.3.2 SOD 活性。

SOD 是植物細(xì)胞中重要的清除自由基的酶類之一，其主要作用是催化

O2·-生成H2O2，并清除細(xì)胞中多余的超氧陰離子。從圖3可看出，對照組和多胺組SOD活性變化情況基本一致，SOD 活性在培養(yǎng)前期急劇下降，最后趨于平緩，說明外源多胺對SOD 的活性影響較小，SOD對于類原球莖芽發(fā)生早期H2O2的積累無明顯作用。

2.3.3 CAT 活性。

CAT作為清除H2O2的主要酶類，能將H2O2分解為H2O和O2。由圖4 可見，多胺組中CAT活性變化是從培養(yǎng)初期開始緩慢上升，第20天達(dá)到最高后迅速下降，而對照組相對比較平緩。在整個(gè)培養(yǎng)過程中，多胺組CAT活性始終高于對照組，CAT活性在培養(yǎng)第20天的Put組和Spd組中分別是對照的1.2和1.3倍，表明外源多胺可顯著提高霍山石斛類原球莖抗氧化酶CAT的催化作用，說明外源多胺在早期（5 d）通過PAO升高H2O2的含量，隨后由CAT分解。

2.3.4 POD 活性。

POD是逆境條件下植物酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一， 它與SOD、CAT合作將過剩的自由基去除，使體內(nèi)保持正常的自由基水平。由圖5 可見，外源多胺對霍山石斛類原球莖芽發(fā)生過程中POD的活性影響較小，說明類原球莖芽發(fā)生早期積累的H2O2不是由POD所降解。

2.3.5 APX 活性。APX是植物細(xì)胞中的H2O2清除酶，由圖6可見，外源添加多胺明顯提高APX的活性，在培養(yǎng)的第5天多胺組中APX活性約為對照組的13%，同時(shí)對照組和多胺組中APX活性變化趨勢一致，與圖1 相比，APX的活性變化與芽發(fā)生過程中H2O2 的積累趨勢一致，說明APX在類原球莖芽發(fā)生早期（5 d）能快速分解大量生成的H2O2。

3 討論與結(jié)論

研究表明，多胺調(diào)節(jié)植物生長的機(jī)制取決于多胺的合成和氧化的同時(shí)還取決于其氧化代謝過程[15-16]。 PAO是涉及多胺氧化代謝的關(guān)鍵酶之一，催化Spd和精胺（Spm）的次級(jí)氨基氧化產(chǎn)生吡咯啉、1-（3-丙氨基）吡咯啉、二氨基丙烷和H2O2 [17]。由于H2O2是PAO催化多胺氧化降解的主要產(chǎn)物之一，PAO活性提高，表明它有利于H2O2的積累[18]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在外源多胺作用下，不僅霍山石斛類原球莖芽發(fā)生率顯著提高，而且2.0 mmol/L Spd或Put處理5 d的培養(yǎng)物中H2O2含量分別比對照組高175.6%和180.6%，芽發(fā)生初期PAO活性和H2O2積累也同步上升，說明多胺促進(jìn)的芽發(fā)生與PAO活性升高促使H2O2積累有關(guān)，H2O2淬滅劑DMTU抑制H2O2積累和芽發(fā)生的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了H2O2積累在多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽發(fā)生中的作用。

H2O2作為植物細(xì)胞中各種應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的重要信號(hào)分子，已被證明參與植物激素的信號(hào)級(jí)聯(lián)及激素調(diào)控植物生長發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19-20]。然而，細(xì)胞中H2O2的過量對植物有毒性，但是它可以被CAT和APX分解[21]。 CAT和APX對H2O2親和力和結(jié)合機(jī)制是不同的，CAT可以直接分解H2O2，但與H2O2的親合力相對較弱；APX需要抗壞血酸作為底物，對H2O2具有很強(qiáng)的親和力。該研究在外源多胺處理前期和中期，SOD和POD活性無明顯改變，而合成H2O2的PAO活性和分解H2O2的APX與CAT活性明顯增加，說明霍山石斛類原球莖在芽發(fā)生早期（5 d）由于外源多胺促進(jìn)了H2O2的產(chǎn)生，引起細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量急速上升，為了使細(xì)胞免于毒害，APX活性急劇上升后迅速下降，而CAT活性在培養(yǎng)中期（20 d）時(shí)達(dá)到最高，說明APX和CAT分別在霍山石斛類原球莖芽發(fā)生的初期和中期對細(xì)胞進(jìn)行解毒。在清除H2O2 毒性過程中，細(xì)胞體內(nèi)氧化還原狀態(tài)和與它們氧化還原反應(yīng)相關(guān)的一些酶類活性水平的變化誘發(fā)了某些調(diào)控植物生長發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的改變[2，22-23]，從而促進(jìn)了霍山石斛類原球莖的芽發(fā)生。

綜上分析，外源多胺促進(jìn)霍山石斛類原球莖芽發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)活性氧信號(hào)可能有關(guān)，外源多胺作用下PAO活性的升高導(dǎo)致了大量H2O2的產(chǎn)生，積累的H2O2由同步升高的APX和隨后升高的CAT分解，在H2O2積累和分解過程中，細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)氧化代謝酶發(fā)生改變，可能參與了多胺促進(jìn)芽發(fā)生的信號(hào)介導(dǎo)。

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