王紅娟 江本利 於春 路獻勇 胡積送 閆曉明 朱加保

摘要 目前關于薏苡分子生物學方面的研究雖然相對其他作物起步較晚，但也取得了一些重要進展。從分子標記、功能基因和基因組測序3個方面綜述了國內(nèi)外關于薏苡的分子生物學研究，討論了薏苡分子水平研究的現(xiàn)狀和發(fā)展方向，為其分子生物學進一步研究提供參考。

關鍵詞 薏苡；分子標記；基因克?。环肿由飳W

中圖分類號 S519文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）01-0010-04

Abstract Studies on the molecular biology of Coix lacryma-jobi L. have made some important progress now， although relatively later than other crops. In this paper， the molecular biology stydy of C. lacryma-jobi L. was reviewed from three aspects： molecular marker， functional gene and genomic sequencing. The existing problems and development direction of C. lacryma-jobi L. molecular level were discussed， which provided a reference for molecular biology research.

Key words Coix lacryma-jobi L.；Molecular marker；Gene cloning；Molecular biology

薏苡（ Coix lacryma-jobi L.），屬于禾本科（Gramineae）薏苡屬（ Coix ）一年生或多年生草本植物。薏苡是一種藥食兼用的糧食作物，同時也具有保健美容的功效，在我國有著悠久的栽培歷史[1-2]。薏苡仁營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、維生素、氨基酸及鈣、鐵等營養(yǎng)成分[3]。作為傳統(tǒng)中藥材，薏苡具有健脾利濕、清熱排膿等藥效，薏苡還含有多種生物活性物質(zhì)，在抗腫瘤、抗炎、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、DPPH 自由基清除等方面具有顯著作用[4]。隨著社會對健康保健的廣泛重視，薏苡的價值逐漸凸顯出來，生產(chǎn)需求不斷增加，圍繞薏苡展開的各項研究也逐漸增多。近年來，國內(nèi)外學者將分子生物學技術(shù)應用到薏苡的種質(zhì)鑒定、生長發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)等方面的研究中，深入解析了薏苡的分子遺傳機理，為薏苡的應用開發(fā)提供了研究基礎。筆者綜述了近年來薏苡分子生物學方面的相關研究，為薏苡的基礎及應用研究提供參考。

1 薏苡分子標記的相關研究

分子標記是分子生物學中的一項重要應用技術(shù)，能從DNA水平進行個體或種群間差異的分析，主要用于遺傳多樣性分析、分子標記輔助育種、親緣關系分析、分子遺傳圖譜構(gòu)建和性狀的定位分析等。隨著分子標記的廣泛應用和薏苡研究深入的需求，分子標記已較多地被應用于薏苡的相關研究。

1.1 遺傳多樣性分析

科研工作者利用多種分子標記研究了薏苡的遺傳多樣性，可為種質(zhì)資源的收集、評價和保護提供分子依據(jù)。

1.1.1 RAPD標記。

Li等[5]通過RAPD（random amplified polymorphic DNA）標記對21份薏苡資源的遺傳關系進行了分析。利用31對引物擴增以上21份材料，共得到205條DNA片段，每對引物平均可以擴增6.61條帶。統(tǒng)計以上擴增出的205條DNA片段，發(fā)現(xiàn)115條多態(tài)性條帶，每對引物平均可以擴增3.71條多態(tài)性帶，共有56.1%具有多態(tài)性，表明這21份材料在DNA水平上具有比較豐富的變異，而且有的材料具有特異條帶。基于以上DNA水平的擴增條帶計算得到這21份材料兩兩間的遺傳相似系數(shù)為0.301～0.809。聚類分析顯示這21份薏苡被劃分為2個主要類群，其中，3個外來的種質(zhì)被聚在一起，3個中國廣西的種質(zhì)被聚在同一亞群，4個野生型被聚在同一亞群。以上RAPD 標記數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果反映了薏苡在地理起源和進化上的遺傳差異。

1.1.2 SSR標記。

Ma 等[6]構(gòu)建了薏苡的富含微衛(wèi)星序列的文庫，并從中篩選出了17個SSR（simple sequence repeats）標記應用于30份薏苡資源的多樣性分析，每個位點的等位基因數(shù)為1～5個，平均2.8個，期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）分別為0～0.676和0～0.666，分析結(jié)果表明所檢測的薏苡資源有較窄的遺傳基礎，但這些引物可以應用到更多薏苡資源的遺傳多樣性評價。Ma等[7]進一步利用以上17個標記評估了79份來自中國和韓國的薏苡資源的遺傳多樣性和遺傳關系，共檢測到57個等位基因，平均每個位點3.4個等位基因。聚類分析結(jié)果顯示，大部分中國的薏苡資源被劃分為一個類群，而所有的韓國薏苡材料被劃分在另一個類群，這說明兩國的薏苡資源在遺傳關系上截然不同。相比韓國的薏苡資源，來自中國的薏苡種質(zhì)資源表現(xiàn)出較大的種群多樣性，表明這些薏苡種質(zhì)資源可以提供新型等位基因，在薏苡育種改良中具有很大的潛力。郭銀萍等[8]從玉米和水稻的SSR引物中篩選出11對多態(tài)性較好的引物，并對22份薏苡種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，共檢測出105個等位基因，PIC是0.304 8～0.923 8，聚類分析將其分為4個類群，結(jié)果與供試種質(zhì)的親緣關系一致，進一步證明SSR標記能有效地鑒定薏苡種質(zhì)資源的遺傳變異關系。

1.1.3 SRAP標記。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）也是一種高效的分子標記，俞旭平等[9]根據(jù)前人的結(jié)果設計了8個正向引物和11個反向引物，并通過對Mg2+、dNTP、BSA的濃度和模板、引物、聚合酶的用量進行單因素試驗分析，建立了優(yōu)化的薏苡的SRAP-PCR反應體系。王碩等[10]在俞旭平等[9]的研究基礎上，對正反引物進行隨機組合，得到88對SRAP 標記引物，從中篩選出6對理想組合，并用這6對引物對收集到的25份薏苡種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，其擴增結(jié)果通過軟件運算得出種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.48～0.82，聚類分析將這25個薏苡種質(zhì)分為4個類群，不同地區(qū)的種質(zhì)并沒有完全聚類在一起，說明薏苡各生態(tài)區(qū)內(nèi)依然保持著較好的遺傳多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，薏苡種質(zhì)資源分子標記聚類結(jié)果[10]與表型多樣性聚類分析[11]相似程度低，這可能與標記和性狀的連鎖緊密度有關，也可能與環(huán)境對表型的影響等有關，其原因有待進一步探索。夏法剛等[12]篩選出26對SRAP標記用于收集到的90份薏苡種質(zhì)的分析，顯示出豐富的遺傳多樣性，并利用16對SRAP標記構(gòu)建了73份薏苡資源的指紋圖譜，為分子標記輔助育種等提供了基礎。

1.1.4 ISSR標記。

Xi等[13]報道他們利用10對ISSR（inter-simple sequence repeat）標記分析了來自2份野生薏苡和9份栽培薏苡的218份樣品，共檢測到103條可重復檢測的片段，其中91（84.47%）條具有多態(tài)性。通過多態(tài)性條帶分析顯示以上11份薏苡材料的遺傳多樣性很低，Nei氏平均預期基因雜合度（ h ）= 0.07，Shannons信息指數(shù)（ I ）= 0.10，不同材料間的遺傳分化系數(shù)很高（ G ST = 0.670 2）。此外，根據(jù)ISSR多態(tài)性條帶結(jié)果進行聚類分析顯示，11份薏苡材料中的9份栽培材料被劃分成3個類群，2份野生型材料各自單獨歸為一類。該聚類結(jié)果與基于地理位置進行劃分的結(jié)果一致。

1.2 物種親緣關系研究

薏苡由于其獨有的營養(yǎng)、功效成分和抗性等特性，長期以來被看作是改良玉米等禾本科作物種質(zhì)的有利資源，薏苡與其他禾本科作物的親緣關系也得到了很多研究。通過傳統(tǒng)的分類學可以分析物種間的近緣關系，Clayton[14]指出薏苡屬是在摩擦禾屬（ Tripsacum ）之后，距離玉米最近的一個屬。Wang等[15]通過研究直系同源區(qū)段得出以下結(jié)論：薏苡和玉米是在大約1 210萬年前產(chǎn)生分化；摩擦禾和玉米則是在大約850萬年前產(chǎn)生分化；薏苡和高粱是在大約930萬年前產(chǎn)生分化；高粱和玉米則是在大約1 240萬年前產(chǎn)生分化。Takahashi等[16]以3個玉米、3個大芻草種、3個高粱、1個摩擦禾種和1個薏苡種質(zhì)為試驗材料，利用基因組原位雜交技術(shù)（GISH）對以上材料進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)玉米、大芻草、摩擦禾和薏苡的原位雜交模式相似，顯示出由分散信號組成的相似雜交模式，相比之下，高粱則只在核仁區(qū)域顯示出雜交信號。

田松杰等[17]利用21對AFLP（amplified fragment length polymorphism）標記研究了50個栽培玉米、大芻草、摩擦禾、薏苡材料的遺傳關系。聚類分析將50個材料分為三大類：摩擦禾屬、薏苡屬、玉蜀黍?qū)?。結(jié)果表明摩擦禾屬是親緣關系僅次于大芻草的玉米近緣屬，比薏苡屬關系更近，此結(jié)果與前人結(jié)果一致。

1.3 遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL（quantitative trait locus）定位

遺傳圖譜即遺傳連鎖圖譜，指基因組中基因及專一的多態(tài)性標記之間相對位置的圖譜。李雪峰[18]利用61對AFLP標記和21對RFLP（restriction fragment length polymorphism）標記將131株薏苡分離群體劃分為11個遺傳連鎖群，并進行了QTL分析。針對該群體的5個重要農(nóng)藝性狀：株高、莖粗、葉長、葉寬及雄穗長，利用WinQTLCart軟件中的復合區(qū)間作圖法進行QTL掃描，結(jié)果表明共檢測到31個QTL位點：株高3個、莖粗8個、葉長7個、葉寬7個及雄穗長6個，解釋的表型變異方差最小的是12.16%，最大的是64.39%。Qin 等[19]針對一個包含131個單株的薏苡F2群體，利用 80對AFLP標記 和 10對RFLP 標記構(gòu)建了長為1 339.5 cM，平均14.88 cM的薏苡遺傳圖譜。該圖譜共包含10條連鎖群，該結(jié)果和薏苡細胞學觀察到的10條連鎖群的結(jié)果一致。這一結(jié)果為定位分離薏苡中的重要基因，研究薏苡基因組結(jié)構(gòu)、起源及與玉米的關系提供了基礎。

2 薏苡功能基因的相關研究

目前，很多有關薏苡的研究均是圍繞高粱、玉米等禾本科的親緣關系展開，相比重要糧食作物來說，薏苡基因水平上的研究相對遲緩。近年來逐漸也有不少薏苡功能基因的研究得到開展，薏苡的文庫構(gòu)建為其功能基因組的研究提供了基礎；基因克隆及鑒定是其主要途徑；轉(zhuǎn)錄組分析為其提供了大量調(diào)控相關基因的信息。

2.1 BAC文庫的構(gòu)建

Meng等[20]在2010年完成了薏苡的第1個BAC（bacterial artificial chromosome）文庫的構(gòu)建，該文庫包含230 400個克隆，平均插入片段為113 kb，具有較低的細胞器DNA污染，覆蓋薏苡基因組16.3倍。他們將該文庫存儲在可以用PCR方法篩選的12個96孔板中。Meng等[20]利用該文庫篩選分離了19個包含22 kDa α-coixin（薏苡的α-醇溶蛋白）基因的BAC克隆。該文庫能夠為薏苡重要基因分離鑒定、比較基因組研究等提供依據(jù)。

2.2 基因的克隆及鑒定

薏苡的醇溶蛋白（prolamin），稱為coixin，是種子的主要存儲蛋白，于1990年分離得到[21]?；谌芙庑缘牟町?，這些醇溶蛋白被分為α-prolamin，γ-prolamin[22]。薏苡的α-prolamin約占總醇溶蛋白的70%，由25和27 kDa的大型多基因家族編碼[23]。此外，薏苡中含有17 kDa coixin [24]，是一個富含硫的蛋白，和玉米的14 kDa β-zein（玉米的β-醇溶蛋白）有高度的相似性[25]，命名為β-coixin[26]。Neto等[26]在薏苡中分離出了玉米中的同源基因 Opaque 2（O2 ），該基因編碼包含一個基本結(jié)構(gòu)域-亮氨酸拉鏈（a basic domain-leucine zipper，bZIP）的DNA結(jié)合因子。研究發(fā)現(xiàn) Opaque 2 基因在薏苡中能夠調(diào)控25 kDa α-coixin 基因家族，同時，該基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控不同類別的β-coixin的結(jié)構(gòu)和形成過程。Vettore等[27]在薏苡中進一步分離了 Opaque 2 的cDNA和基因組序列。根據(jù)bZIP結(jié)構(gòu)域相似性分析發(fā)現(xiàn)O2蛋白與OHP1，OsBZIPPA，SPA，CPRF2和RITA1一起被劃分到植物bZIP家族五類中的同一個分枝中。

Dante等[28]從薏苡中克隆了 DapA 基因，該基因包含2個內(nèi)含子，編碼326個氨基酸構(gòu)成的賴氨酸生物合成酶——二氫吡啶二羧酸合酶（DHPS）；與玉米的DHPS相似性高達95%。RNA凝膠印跡分析顯示DHPS轉(zhuǎn)錄本存在于胚芽鞘、胚胎、胚乳和根中，但是在薏苡的葉片中幾乎無法檢測到。Yoza等[29]從薏苡成熟種子構(gòu)建的cDNA文庫中克隆了薏苡中的半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（ Cystatin ），其cDNA長757 bp，編碼135個氨基酸。序列分析發(fā)現(xiàn)Cystatin蛋白的中央?yún)^(qū)氨基酸Gln-Val-Val-Ala-Gly可能是其結(jié)合區(qū)域。吳功慶[30]根據(jù)玉米等作物的乙醇脫氫酶基因（ ADH1 ）和丙酮酸脫羧酶基因（ PDC1 ）的保守序列設計引物，分析了淹水脅迫下二者在薏苡根尖及葉片中的表達模式和相對應的酶活性變化，并以薏苡根尖的總RNA為材料分離得到743 bp的 ADH1 基因cDNA片段（Accession DQ455071）和498 bp的 PDC1 基因cDNA片段（Accession DQ455583），生物信息學分析發(fā)現(xiàn)克隆得到片段與其他禾本科物種的基因相似性很高。RT-PCR檢測結(jié)果顯示 ADH1和PDC1 基因在葉片中表達量很低，然而在根尖組織里二者具有較高的表達量。朱云芬等[31]通過RACE 技術(shù)在吳功慶[30]的基礎上克隆了薏苡的乙醇脫氫酶基因（ ADH1 ）的cDNA 3′末端，與已知的cDNA片段（Accession DQ455071）進行拼接得到1個1 234 bp的cDNA序列。Fu 等[32]克隆了玉米、大芻草、摩擦禾、薏苡、高粱和水稻中的類胡蘿卜素合成第一限速酶（八氫番茄紅素合成酶） PSY1-like 基因，并分析了核酸多態(tài)性和這些基因間的系統(tǒng)進化關系。 PSY1-like 基因系統(tǒng)進化樹分析顯示薏苡和玉米在很早期就開始分化。 Hachiken等[33]通過PCR的方法從非糯性薏苡品種中分離得到了 Waxy 基因的全長編碼序列，該基因是直鏈淀粉合成途徑中的關鍵基因。比對2個非糯性品種和3個糯性品種的基因全長序列，發(fā)現(xiàn)糯性品種中該基因編碼區(qū)中有275 bp片段缺失。PCR分析發(fā)現(xiàn)在日本和韓國的薏苡品種中普遍存在這個缺失。在花粉和胚乳中這個基因的多態(tài)性與表型共分離。這個共分離PCR標記將對薏苡的遺傳育種非常有用。王健等[34]報道他們在薏苡中克隆了 Waxy 基因，序列分析表明該基因全長1 845 bp，包含13個內(nèi)含子，編碼614個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，包含3個保守結(jié)構(gòu)域。該基因蛋白序列與高梁中的 Waxy 基因的蛋白序列同源性最高（93%），蛋白保守性較高。

Dias 等[35]在組織、轉(zhuǎn)錄和 RNA 編輯水平上鑒定了薏苡線粒體中 trn S /pseudo-t RNA/ nad3/rps12 基因簇的特征特性。他們利用線粒體探針 orf167 將以上基因簇雜交出來之后進行克隆、測序及基因的表達分析。通過和小麥及玉米中對應的基因簇比對分析發(fā)現(xiàn)以上基因簇的基因序列及基因位置具有相似的特征。Northern雜交和RT-PCR反應分析表明， nad3和rps12 基因共轉(zhuǎn)錄為1.25 kb RNA分子。轉(zhuǎn)錄本分析表明 nad3和rps12 基因中分別有20和6個RNA編輯位點，導致密碼子改變，這些變化在不同物種中具有較好的保守性。

2.3 轉(zhuǎn)錄組分析

黃玉蘭等[36]通過對薏苡抗旱品種薏遼5號轉(zhuǎn)錄組測序分析了薏苡的基因數(shù)據(jù)和功能，共獲得92 865 條unigenes，通過數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)有39.87%（35 813條）的unigenes在數(shù)據(jù)庫中有注釋。GO（Gene Ontology）分析顯示，有1 053條unigenes可能是由參與干旱脅迫的基因轉(zhuǎn)錄而形成。進一步分析顯示其中包含有409條編碼植物激素和125條滲透因子合成酶的unigenes。

3 薏苡基因組測序的相關研究

在基因組水平上，研究者率先展開了薏苡的質(zhì)體基因組研究。Leseberg 等[37]對薏苡的葉綠體進行測序分析，得到薏苡葉綠體基因組序列長為145 745 bp，分析發(fā)現(xiàn)62個編碼蛋白質(zhì)的基因中有50個具有部分或者全長的編碼區(qū)，測序數(shù)據(jù)包含薏苡葉綠體中近70%的基因。此外，他們發(fā)現(xiàn)序列發(fā)生了很大變異的一些基因家族，還觀察到易于解釋的突變模式，例如在發(fā)夾環(huán)區(qū)和indel中的小的反轉(zhuǎn)，其在基因間是常見的。

薏苡屬包含不同倍性（ 2n =10，20，30和40）的材料[38]。Cai等[39-40] 對栽培種薏苡（ C.lacryma-jobi L.， 2n =20）和一種不育類型的水生薏苡（ C.aquatica HG， 2n =30）進行了基因組低覆蓋度隨機測序，并通過重復序列分析和精細核型分析了二者在基因組組成和進化歷史上的差異。基因組序列分析顯示 C.lacryma-jobi L.76%的基因組和 C.aquatica HG 73%的基因組為重復DNA序列。長末端重復（LTR）反轉(zhuǎn)錄元件是這2個基因組中的主要重復序列，并且全基因組中許多重復序列的比例在2個物種之間變化很大，表明它們的進化差異。染色體原位雜交（減數(shù)分裂中期染色體配對）結(jié)果顯示 C.lacryma-jobi L.可能是二倍體物種， C.aquatica HG可能是最近形成的雜交種。此外，與玉米相比， C.lacryma-jobi L.、 C.aquatica HG和高粱具有更多共同的重復家族以及更高的序列相似性。

4 薏苡分子生物學研究的問題及展望

薏苡是藥食同源的傳統(tǒng)作物，近年來受到廣泛關注，關于薏苡分子生物學研究的相關報道也逐年增多，但是研究還處于初級階段。利用分子標記開展薏苡種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和分析薏苡與其他禾本科作物的親緣關系已得到較全面的研究，能為薏苡種質(zhì)的收集、評價、利用與保護提供重要的參考。但由于薏苡可應用的序列信息很少，遺傳育種也處于起步階段，所以深入的基因定位和分子標記輔助育種也沒有得到更多的關注。雖然薏苡中陸續(xù)也有一些基因報道，但大多停留在生物信息學分析或表達分析的層面，切實的基因功能、代謝與調(diào)控等都沒有得到很好的解析，相應的遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段也有待完善。測序技術(shù)也被應用于薏苡的基因組學研究，揭示了大量的薏苡基因信息，但由于薏苡還沒有完成全基因組測序，所以，相應的生長發(fā)育、代謝調(diào)控等信息也不能很好地被揭示。

隨著薏苡保健功能的開發(fā)利用，薏苡的相關研究將進一步深入。后續(xù)研究需要繼續(xù)開發(fā)更多的分子標記，豐富指紋圖譜，加密遺傳圖譜，建立大規(guī)模的定位群體，為分子標記輔助選擇育種、優(yōu)良農(nóng)藝性狀的基因定位和創(chuàng)新種質(zhì)資源等創(chuàng)造基礎。薏苡以其特殊的成分和較強的抗性一直被作為改良玉米等主要作物的基因來源，所以針對薏苡優(yōu)良性狀的基因克隆和功能鑒定值得被廣泛關注。薏苡的轉(zhuǎn)基因或基因沉默等技術(shù)的建立完善，將為薏苡和玉米等作物的性狀改良提供儲備。高通量測序技術(shù)也應被更多地應用到薏苡的研究中，可以為研究者提供大量的基因組信息，為全面認識薏苡調(diào)控發(fā)育網(wǎng)絡提供幫助。此外，將分子生物學相關技術(shù)全面地應用到薏苡研究中，才能更好地解析薏苡的遺傳基礎，為薏苡資源的應用奠定基礎。

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