姜碩 許哲祥 王宇晴等

摘要 [目的]研究甘草內(nèi)生真菌GYP8活性代謝物，豐富pseurotin A植物內(nèi)生真菌資源庫(kù)。[方法] 利用HPLC法對(duì)GYP8發(fā)酵液進(jìn)行分析；采用柱色譜分離法對(duì)GYP8 活性成分進(jìn)行分離、純化；采用形態(tài)特征觀察法及18SrDNA 序列分析對(duì)內(nèi)生真菌GYP8進(jìn)行菌種鑒定。[結(jié)果]內(nèi)生真菌GYP8發(fā)酵液中含有pseurotin A，經(jīng)鑒定該菌為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。[結(jié)論] GYP8是pseurotin A產(chǎn)生菌，該菌的獲得可為pseurotin A成分的生產(chǎn)提供新方法。

關(guān)鍵詞 pseurotin A；內(nèi)生真菌；鑒定

中圖分類號(hào) R931 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）32-0085-03

Identification of Pseurotin Aproducing Endophytic Fungus GYP8

JIANG Shuo1，2， XU Zhexiang1，2， WANG Yuqing1，2 et al

（1.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150500；2.Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences， Heilongjiang University， Harbin， Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective]To study the active metabolites of endophytic fungi GYP8 from Glycyrrhiza uralensis and enrich the pseurotin A endophyte resource pool. [Method]The fermentation broth of GYP8 was analyzed by HPLC.The positive components of GYP8 were separated and purified by column chromatography.Strain identification of the endogenous fungi GYP8 was performed by morphological observation and 18SrDNA sequence analysis.[Result]Compound pseurotin A was isolated from the fermentation broth of GYP8 and endophytic fungus GYP8 was identified as Aspergillus fumigatus.[Conclusion] GYP8 is a pseurotin Aproducing endophytic fungus， which provides a new means for development and application of pseurotin A.

Key words Pseurotin A；Endophytic fungus；Identification

基金項(xiàng)目 黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（面上項(xiàng)目）（H2015003）。

作者簡(jiǎn)介 姜碩（1997—），女，黑龍江大慶人，碩士研究生，研究方向：微生物制藥。*通訊作者，教授，博士，從事微生物制藥研究。

收稿日期 2018-09-27

pseurotin A為重要的微生物次生代謝產(chǎn)物，是酰胺類生物堿[1]，也是重要的生化試劑，是阿樸嗎啡拮抗劑，能抑制殼聚糖合成和單胺氧化酶活性，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用，其主要生產(chǎn)渠道為從微生物代謝產(chǎn)物中分離得到[2]。

筆者在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)具有潛在應(yīng)用價(jià)值的烏拉爾甘草內(nèi)生真菌GYP8發(fā)酵液進(jìn)行分析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中含有pseurotin A，該化合物首次從子囊菌（Pseudeurotium ovalis STORK）發(fā)酵液中分離得到[3]。隨著對(duì)pseurotin A活性的深入研究，人們開始對(duì)pseurotin A及其類似物進(jìn)行化學(xué)合成以提高產(chǎn)量，但化學(xué)合成生產(chǎn)pseurotin A具有環(huán)境污染、試劑消耗高、成本高等缺點(diǎn)，因此發(fā)掘新型高產(chǎn)pseurotin A菌株是目前研究的課題。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)

供試菌為內(nèi)生真菌GYP8，分離自野生烏拉爾甘草葉（采集地為黑龍江省大慶地區(qū)）。PDA培養(yǎng)基同參考文獻(xiàn)[4]。

1.2 儀器與試劑

FL2200高效液相色譜儀（浙江溫嶺）。

18SrDNA擴(kuò)增通用引物NS1（5-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3）和NS6（5-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3），由上海生工生物工程股份有限公司合成。

試劑：甲醇為色譜純級(jí)別，其他試劑均為分析純。

1.3 內(nèi)生真菌GYP8發(fā)酵液制備

取已活化的甘草內(nèi)生真菌GYP8接種于60 mL液體馬鈴薯培養(yǎng)基中（搖床培養(yǎng)28 ℃，140 r/min，3 d），制成1×107 CFU/mL種子培養(yǎng)液。取種子液以5%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接至300 mL 液體馬鈴薯培養(yǎng)基中（搖床培養(yǎng)28 ℃，140 r/min，14 d），抽濾，濾液于50 ℃減壓濃縮，作為發(fā)酵液供試品。

1.4 GYP8發(fā)酵液中活性成分分析與分離

1.4.1 GYP8發(fā)酵液中活性成分分析。

取“1.3”供試品，40 ℃真空減壓抽干后，加入1 mL甲醇溶解，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取濾液作為供試品溶液。采用HPLC法，分別精密吸取 0.5 mg/mL 的pseurotin A對(duì)照品液及供試品液各 10 μL 注入HPLC儀器，HPLC檢測(cè)條件為Venusil XBP-C18柱（柱4.6 mm×250 mm，5 μm，USA）；流動(dòng)相為甲醇∶水∶甲酸（60∶40∶0.5）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.4.2 GYP8發(fā)酵液中活性成分分離。

取“1.3”制備GYP8菌株發(fā)酵液10 L，50 ℃減壓濃縮至200 mL，以乙酸乙酯萃取3次（3×100 mL），合并萃取液后減壓濃縮，進(jìn)行硅膠柱分離，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶5為洗脫劑，用薄層鑒別（TLC）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)（GF254薄層板，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸=15∶15∶2）（100 mm×200 mm），依據(jù)TLC檢識(shí)結(jié)果，合并成分相似或相同的洗脫液；得粗晶體后二次硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯=15∶15為洗脫劑，根據(jù)薄層鑒別結(jié)果合并洗脫液，回收溶劑，重結(jié)晶，得到化合物單體。

1.5 內(nèi)生真菌GYP8的鑒定

1.5.1

內(nèi)生真菌GYP8形態(tài)學(xué)鑒定。參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。采用平板PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)GYP8（28 ℃，7 d），觀察形態(tài)特征；同時(shí)取同培養(yǎng)2 d的GYP8 PDA平板，將滅菌蓋玻片傾斜插入該平板中，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，取出，取蓋玻片，清除背面附著物，顯微鏡下觀察GYP8菌株的孢子顯微特征，初步確定菌株的分類地位[6]。

1.5.2

內(nèi)生真菌GYP8 18SrDNA序列擴(kuò)增及序列分析。參閱文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物純化后，測(cè)序工作委托上海生工生物工程股份有限公司完成。所測(cè)得序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定GYP8菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 GYP8發(fā)酵液中活性成分分離結(jié)果

2.1.1 GYP8發(fā)酵液中活性成分分析結(jié)果。按“1.4.1”HPLC分析，甘草內(nèi)生真菌GYP8發(fā)酵液中可能含有pseurotin A，供試品色譜中，在與pseurotin A對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上，有相同的色譜峰出現(xiàn)（圖1），PDA空白培養(yǎng)基相應(yīng)保留時(shí)間位置未見任何色譜峰出現(xiàn)。

2.1.2

GYP8發(fā)酵液中活性成分分離結(jié)果。按“1.4.2”分離方法所得為無(wú)色粉末狀結(jié)晶。薄層鑒別結(jié)果顯示，該晶體與pseurotin A對(duì)照品在相同位置顯相同顏色斑點(diǎn)（圖2）。MS鑒定結(jié)果為Positive MS：454.3[M+Na]+，885.4[2M+Na]+，Negetive MS：429.9[M-H]-，861.5[2M-H]-。1H-NMR（MeOD，400 MHz）δ：4.57（dd，J=6.4，8.8 Hz，H-11），5.36（dd，J=8.8，9.8 Hz，H-12），

2.2 內(nèi)生真菌GYP8鑒定結(jié)果

2.2.1

內(nèi)生真菌GYP8形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。甘草內(nèi)生真菌GYP8菌落翠綠色，邊緣白色，產(chǎn)生翠綠色粉末，基質(zhì)淡黃色（圖4）；甘草內(nèi)生真菌GYP8菌株的分生孢子呈穗圓筒形，顏色深淺不一，分生孢子梗綠色光滑無(wú)突起，頂囊向外突出呈現(xiàn)燒瓶狀，且只有上半部產(chǎn)生孢子（圖5）。

2.2.2

內(nèi)生真菌GYP8 18SrDNA序列擴(kuò)增及序列分析結(jié)果。甘草內(nèi)生真菌GYP8 DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1條1 305 bp的特異性條帶（圖6），將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，然后用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖7），內(nèi)生真菌GYP8序列（登錄號(hào)：KR233004）與Aspergillus fumigates（M60300.1）序列的同源性最高，相似性為99%。綜合鑒定結(jié)果，確定甘草內(nèi)生真菌GYP8為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

3 結(jié)論

該研究從烏拉爾甘草葉片中分離得到內(nèi)生真菌GYP8，對(duì)其進(jìn)行活性代謝物研究發(fā)現(xiàn)，在其發(fā)酵液中存在大量活性化合物，并且存在與宿主植物烏拉爾甘草相似的化合物。選擇內(nèi)生真菌GYP8作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究，從其發(fā)酵液中分離得pseurotin A，對(duì)菌株GYP8進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果為煙曲霉（Aspergillus fumigatus），該菌株為pseurotin A產(chǎn)生菌。

參考文獻(xiàn)

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