大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠化療的輔助作用及其機制研究

呂曉文 柳全文 侯蘭梅 卞菲菲 宋新娜 張恩寧 付愛芹 張婷 王曉潔

摘要 [目的]探討大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠化療的輔助作用及其機制。[方法]采用 MTT法測定大麥苗復(fù)合粉體外對小鼠S-180瘤細胞的抑制作用和對巨噬細胞的促增殖作用，并篩選出適宜用量用于體內(nèi)試驗。建立小鼠S-180腫瘤模型，化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）連用3 d，同時大麥苗復(fù)合粉連續(xù)灌胃15 d，觀察其對荷瘤小鼠瘤質(zhì)量、 肝脾指數(shù)及血細胞的影響。 [結(jié)果]化療時配用大麥苗復(fù)合粉可顯著提高荷瘤小鼠的抑瘤率為74.3%，單純化療組為45.9%，小鼠一般狀態(tài)優(yōu)于化療組，且顯著提高小鼠脾臟指數(shù)、中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的數(shù)量（ P<0.05）；體外大麥苗復(fù)合粉有顯著抑制小鼠S-180瘤細胞的作用，對巨噬細胞的作用同鹽酸左旋咪唑。[結(jié)論]大麥苗復(fù)合粉有抵抗化療藥引起的淋巴細胞的減少，使化療的同時不失去對免疫細胞的監(jiān)控作用，并可減輕化療藥物的毒副作用。

關(guān)鍵詞 大麥苗粉；綠茶粉；腫瘤；化療

中圖分類號 R151.4+1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）31-0157-06

Abstract [Objective]To explore the auxiliary function of barley seedling compound power on chemotherapy in tumor bearing mice and its mechanism. [Method]MTT test was employed to measure the inhibitory effect of barley seedling compound power on S180 sarcoma cells and the proliferation promotion effect of barley seedling compound power on Macrophages， and then selected a suitable dosage for further vivo experiment. S180 sarcoma models of mice was built up， Chemotherapy drug（5FU） was used for 3 days in a row while barley seedling compound power for 15 days continuously. The influence of the quality of tumor， the liver spleen index and blood cells in tumor bearing mice was observed afterwards. [Result]Barley seedling compound power can obviously restain S180 sarcoma of the proliferation and on the amount of macrophages with Levamisole hydrochloride in vitro.Therefore， chemotherapy withbarley seedling compound power can significantly improve the inhibition rate by 74.3% of tumor bearing mice， while its rate of chemotherapy group （5FU） was only 45.9%. Besides， the general body state of the mice treated by chemotherapy with barley seedling compound power is better than that of chemotherapy group. And it can significantly improve the spleen index of mice， improve the number of the neutrophils， monocytes， lymphocytes and eosinophils （P<0.05）. [Conclusion]Barley seedling compound power has resistance to chemotherapeutic drugs induced lymphopenia， which dont lose monitoring impact on immune cells at the time of chemotherapy， and can reduce the side effects of chemotherapy drugs.

Key words Barley seedling compound power；Green tea powder；Tumor；Chemotherapy

腫瘤的化療藥物治療是目前常規(guī)的腫瘤治療方式之一，化療藥物對免疫細胞的殺傷則是化療藥物最大的毒副作用。在抗腫瘤中細胞免疫起著重要的作用，化療能否成功與化療期間化療藥物對機體免疫細胞的影響有密切關(guān)系[1-5]。大麥苗復(fù)合粉（已由煙臺昊清生物科技有限公司轉(zhuǎn)化生產(chǎn)出系列腫瘤病人化療期間的營養(yǎng)品，如呵本等系列植物源蛋白復(fù)合粉），它的主要成分是大麥苗、綠茶、金銀花、桑葉、荷葉等植物超微粉組成，富含抗氧化麥綠素多酚、酚青花素、β-胡蘿卜素、硒、鍺、黃酮、生物堿，膳食纖維等[6-7]。筆者課題組前期也進行了大量的相關(guān)研究，試驗表明富鍺、富硒大麥苗具有抗腫瘤、增強機體免疫力、保肝、保胃等功能[8-13]。

大麥苗復(fù)合粉是在大麥苗的基礎(chǔ)上配以清熱解毒的藥食同源的植物綠茶等，旨在能夠去除自由基毒素，平衡免疫力及減輕化療藥的毒副作用。大麥苗復(fù)合粉富含膳食纖維，有助于維持正常的腸道功能。該試驗通過大麥苗復(fù)合粉對常規(guī)化療方案的小鼠腫瘤模型的作用，觀察大麥苗復(fù)合粉在體內(nèi)外對腫瘤和免疫細胞的作用，探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供試驗方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試劑。大麥苗復(fù)合粉：由大麥苗30 g，綠茶30 g，桑葉20 g，荷葉10 g，金銀花10 g，5種原料組成[大麥苗符合衛(wèi)生部公告2012年第8號標準的規(guī)定；綠茶符合綠茶國家標準GB/T14456.1—2008；荷葉符合中國藥典（2015版一部）荷葉項下要求；桑葉符合中國藥典（2015 版一部）桑葉項下要求；金銀花符合中國藥典（2015版一部）金銀花項下要求]。大麥苗復(fù)合粉的配制：按配方量稱取5種原料超微粉使用。 ①體外試驗：用RPMI 1640培養(yǎng)液，配成0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL 4個濃度梯度溶液，用0.45和0.22 μm濾膜分別過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。②體內(nèi)試驗：用滅菌的生理鹽水配制為0.125 g/mL的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。氟尿嘧啶注射液（批準文號：國藥準字H12020959），天津金耀氨基酸有限公司；二甲基亞砜（DMSO）（AR），天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；四甲基偶氮唑蘭（MTT）， Sigma公司。5-FU的配制：5-FU用滅菌生理鹽水配制濃度為288 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?。鹽酸左旋咪唑的配制：滅菌生理鹽水配成2.5 μg/mL溶液，0.45 μm濾膜濾菌，4 ℃保存，保存時間不能超過4 d，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。MTT的配制：用pH 7.4，0.01 mol/L的PBS，配成5 mg/mL溶液，濾菌，4 ℃避光保存。RPMI-1640培養(yǎng)基，批號D406FA000 BBI LifeSciences公司。

1.1.2 動物。健康昆明種小鼠（雌性，體重18～25 g），購自山東綠葉制藥有限公司實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（魯）20090009；鼠肉瘤細胞S-180瘤株來自上海細胞所。

1.1.3 主要儀器。超凈工作臺；CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO）；MCO-17A倒置相差顯微鏡（COIC XDS-1B）；TDL-5離心機；電子天平；電熱恒溫水浴鍋；生化培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 大麥苗復(fù)合粉體外對S-180瘤細胞抑制作用和巨噬細胞增殖作用試驗。

1.2.1.1 大麥苗復(fù)合粉體外對S-180瘤細胞抑制作用試驗。

取對數(shù)期生長S-180瘤細胞，用含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液配成密度為5×104～2×105 個/mL 的細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培2 h后，設(shè)試驗組：大麥苗復(fù)合粉4個梯度；化療藥物對照組（5-FU）；免疫增強劑對照組（鹽酸左旋咪唑）；陰性對照組（RPMI 1640培養(yǎng)液），每組設(shè)6個重復(fù)，將以上各組藥品取分別100 μL加入接種細胞的培養(yǎng)孔中。常規(guī)培養(yǎng)，24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)上清。每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，用酶標儀測波長490 nm 處OD值，計算S-180細胞抑制率，見公式（1）：

細胞生長抑制率=OD2-OD1OD2（1）

式中，OD1為試驗組平均OD 值；OD2 為對照組平均OD值。

1.2.1.2 大麥苗復(fù)合粉體外對巨噬細胞增殖作用試驗。

選取1只健康小鼠，斷頸處死，以RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗收集腹腔巨噬細胞至離心管中，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，用 RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，并將細胞密度調(diào)整到 5×104～ 2×105個/mL，接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h[14]，其后試驗分組與試驗方法同“1.2.1.1”，試驗結(jié)束計算巨噬細胞增殖率，見公式（2）：

細胞生長增殖率=OD1OD2×100%（2）

式中，OD1為試驗組平均OD 值；OD2 為對照組平均OD值。

1.2.2 大麥苗復(fù)合粉對化療期荷瘤小鼠作用試驗。

首先建立小鼠腫瘤模型，取對數(shù)期生長的小鼠S-180細胞，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107個/mL，無菌條件下用1 mL注射器將S-180細胞接種于小鼠右前肢腋下皮下，接種量為0.2 mL/只[9]。小鼠接瘤后第7天，將造模小鼠隨機分為3組，每組6只?；熕幗M：腹腔注射5-FU，0.2 mL/只，1次/d，連續(xù)3 d；大麥苗復(fù)合粉組：注射化療藥的同時灌胃大麥苗復(fù)合粉，0.2 mL/只，1次/d，連續(xù)15 d。腫瘤對照組：灌胃生理鹽水，用量和時間同大麥苗復(fù)合粉組。正常對照組：不作任何處理。試驗結(jié)束時，分別測小鼠體質(zhì)量、瘤質(zhì)重、肝脾質(zhì)量，斷頭取血，五分類法常規(guī)測定血細胞，并按公式（3）、（4）分別計算抑瘤率、肝脾指數(shù)[15]。

抑制率=對照組平均瘤質(zhì)量-試驗組平均瘤質(zhì)量對照組平均瘤質(zhì)量×100%（3）

肝脾指數(shù)=肝脾質(zhì)量（mg）體質(zhì)量（g）×100%（4）

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

每個試驗至少重復(fù)3次，對試驗結(jié)果采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標準差（±s）表示，F(xiàn)檢驗方差齊性，再根據(jù)方差齊性進行等方差或異方差的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥苗復(fù)合粉體外對S-180瘤細胞抑制作用和巨噬細胞增殖作用

2.1.1 大麥苗復(fù)合粉體外對S-180瘤細胞的作用。

由表1和圖1可見，4個濃度的大麥苗復(fù)合粉均有抑制S-180瘤細胞的作用，且濃度在0.05～0.15 g/mL時，抑制率與劑量呈正相關(guān)；當(dāng)濃度大于0.15 g/mL時，大麥苗復(fù)合粉對S-180瘤細胞的抑制率呈下降趨勢。鹽酸左旋咪唑?qū)-180瘤細胞的抑制率為負值。4個濃度的大麥苗復(fù)合粉與5-FU組相比，均具有極顯著差異（P<0.01）。

2.1.2 大麥苗復(fù)合粉體外對巨噬細胞增殖的作用。

由表2和圖2可知，4個濃度的大麥苗復(fù)合粉對巨噬細胞增殖率隨濃度增加而呈下降趨勢。4個濃度的大麥苗復(fù)合粉與鹽酸左旋咪唑組相比，均無顯著性差異。

2.2 大麥苗復(fù)合粉體外對化療期間荷瘤小鼠的作用

2.2.1 大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠機體一般狀態(tài)的影響。

由圖3可見，試驗前后，大麥苗復(fù)合粉組小鼠體毛色亮且光滑，小鼠活潑；腫瘤對照組：小鼠體毛色沒有差別；化療組：試驗前小鼠體毛色光亮，試驗后小鼠體毛豎起變稀疏不光滑，小鼠萎靡。

2.2.2 大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠體質(zhì)量和瘤質(zhì)量的影響。

由表3和圖4可見，體質(zhì)量：試驗結(jié)束后，正常組和腫瘤對照組體質(zhì)量差值為正值，說明試驗后體質(zhì)量是增加的，大麥苗復(fù)合粉組和化療組體質(zhì)量差值是負值，說明試驗后體質(zhì)量是減少的。瘤質(zhì)量：大麥苗復(fù)合粉組（P<0.01）和化療組（P<0.05）顯著低于腫瘤對照組，大麥苗復(fù)合粉組顯著低于化療組（P<0.05）。抑瘤率：化療組的腫瘤抑瘤率達到45.9%，大麥苗復(fù)合粉組的抑瘤率達到74.3%。

2.2.3 大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠免疫器官的影響。

由表4可見，肝臟指數(shù)：大麥苗復(fù)合粉組、化療組和腫瘤對照組均顯著高于正常組（P<0.05）；脾臟指數(shù)：大麥苗復(fù)合粉組顯著高于腫瘤對照組和化療組（P<0.05）。

2.2.4 大麥苗復(fù)合粉對荷瘤小鼠免疫細胞的影響。

針對血常規(guī)檢測報告的24項中的免疫細胞進行統(tǒng)計學(xué)分析，見表5。

紅細胞總數(shù)：大麥苗復(fù)合粉組和化療組均顯著低于正常組（P<0.05）。血小板總數(shù)：大麥苗復(fù)合粉組、化療組顯著高于腫瘤對照組（P<0.05）。白細胞總數(shù)：試驗組與對照組均無顯著差異。淋巴細胞絕對值：大麥苗復(fù)合粉組顯著高于腫瘤對照組（P<0.05）和化療組（P<0.01），化療組顯著低于腫瘤對照組（P<0.05）。單核細胞絕對值：大麥苗復(fù)合粉組和化療組顯著高于腫瘤對照組（P<0.01），且大麥苗復(fù)合粉組顯著高于化療組（P<0.01）。嗜中性粒細胞絕對值：大麥苗復(fù)合粉組顯著高于腫瘤對照組（P<0.01）和化療組（P<0.05）。嗜酸性粒細胞絕對值：大麥苗復(fù)合粉組顯著高于化療組（P<0.05）和腫瘤對照組（P<0.01）。嗜堿性粒細胞絕對值：大麥苗復(fù)合粉組（P<0.01）和化療組（P<0.05）顯著低于腫瘤對照組。

3 討論

該研究通過大麥苗復(fù)合粉體外對小鼠S-180瘤細胞和巨噬細胞的作用及體內(nèi)對荷瘤小鼠化療輔助抗腫瘤的試驗，初步觀察到，大麥苗復(fù)合粉在體外對S-180瘤細胞有一定的抑制作用，對巨噬細胞的增殖作用與免疫增強劑鹽酸左旋咪唑沒有差異，但隨濃度的增加有下降的趨勢。體外試驗大麥苗復(fù)合粉在0.10～0.15 g/mL濃度范圍內(nèi)對S-180瘤細胞的抑制作用呈正相關(guān)，而對巨噬細胞的增殖作用下降也不是特別明顯，所以在體內(nèi)試驗時選擇0.125 g/mL的濃度灌胃，結(jié)果證明了大麥苗復(fù)合粉對化療期間的腫瘤小鼠具有一定的輔助抗腫瘤作用。

該試驗從免疫器官分析：大麥苗復(fù)合粉組、化療組和腫瘤對照組肝指數(shù)均顯著高于正常組，肝臟是機體主要的代謝解毒器官，肝指數(shù)的增加提示以上3種狀態(tài)均使肝功能活性增加；大麥苗復(fù)合粉組、腫瘤對照組和化療組的脾指數(shù)顯著高于正常組，大麥苗復(fù)合粉組又顯著高于腫瘤對照組和化療組，這和體外試驗大麥苗復(fù)合粉組與免疫增強劑鹽酸左旋咪唑無差異相一致。從免疫細胞分析：化療藥5-FU組紅細胞總數(shù)、淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值、嗜中性粒細胞明顯低于正常組，而大麥苗復(fù)合粉組的淋巴細胞絕對值、單核細胞絕對值、嗜中性粒細胞絕對值和嗜酸性粒細胞絕對值都顯著高于化療組。綜合這些結(jié)果可見，大麥苗復(fù)合粉可有效減輕5-FU引起的淋巴細胞、單核細胞和粒細胞數(shù)量降低，從而緩解5-FU引起的免疫細胞下降，其機制可能是化療藥5-FU殺傷腫瘤細胞時，死傷的腫瘤細胞通過損傷識別模式（DAMP）引起機體的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)，如肝脾指數(shù)增加，單核細胞、血小板增加，但淋巴細胞絕對值且顯著低于正常組。淋巴細胞降低的原因可能是：當(dāng)DAMP啟動免疫應(yīng)答從固有免疫轉(zhuǎn)化到適應(yīng)性免疫應(yīng)答時，出現(xiàn)以T淋巴細胞為主的快速分裂增殖，此時5-FU則抑制了其DNA的合成，使淋巴細胞的數(shù)量明顯減少。而大麥苗復(fù)合粉中的大麥苗、綠茶、荷葉、桑葉均含豐富的葉綠素、黃酮、麥綠素多酚，青花素、β-胡蘿卜素、硒、鍺、超氧化物歧化酶、生物堿等[6-7]，可較強地去除自由基，加速體內(nèi)腫瘤細胞死亡毒素的代謝，避免了這些腫瘤細胞死亡毒素引起的DAMP強烈的免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的T淋巴細胞因過速分裂增殖被5-FU抑制最終造成T淋巴細胞減少。因而大麥苗復(fù)合粉起到了調(diào)節(jié)免疫細胞平衡的作用。體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，大麥苗復(fù)合粉組的腫瘤抑制率74.3%明顯高于化療組45.9%，也支持了這一點，即在化療時配合使用大麥苗復(fù)合粉起到了調(diào)節(jié)免疫細胞平衡的作用，淋巴細胞絕對值明顯高于單獨化療組，抗腫瘤的效果增加。

腫瘤本身以及化療藥都會引起機體和腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生一定的無菌性炎癥反應(yīng)[16]，嗜堿性粒細胞是導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)的主要細胞，而嗜酸性粒細胞則是抗過敏的主要細胞[17-18]。從試驗結(jié)果可見，大麥苗復(fù)合粉可顯著提高嗜酸性粒細胞絕對值，同時顯著降低嗜堿性粒細胞絕對值，說明大麥苗復(fù)合粉具有一定的抗炎癥反應(yīng)。這可能是因為大麥苗復(fù)合粉中大麥苗、綠茶、荷葉、桑葉和金銀花均有清熱解毒的作用[19-21]，大麥嫩葉中的某些蛋白質(zhì)能中和有害物質(zhì)，如糖蛋白DI-GI具有抗炎癥效應(yīng)[22]，麥綠素多酚、花青素等都是抗炎癥、抗氧化的功能成分[23]，如金銀花中含有的綠原酸腹腔注射0.25 g/kg，能抑制大鼠巴豆油角叉菜性腳腫[24]。腫瘤相關(guān)性炎癥反過來又可以促進腫瘤細胞不斷地更新和增殖[25-26]，可以抑制腫瘤相關(guān)性炎癥反應(yīng)，抑制化療引起的炎癥，可改善癌癥的治療效果，提高患者的存活率[27]。