卷煙加工及儲(chǔ)存過(guò)程中細(xì)菌群落組成及變化研究

陳興　楊瑩　李珊輝

摘要[目的]研究卷煙加工及儲(chǔ)存過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的變化。[方法]采用二代高通量測(cè)序平臺(tái)，以云煙（軟珍，R）不同制絲工藝的加工工序及儲(chǔ)存過(guò)程的煙葉表面微生物為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行16S rRNA 基因高通量測(cè)序。[結(jié)果] 盡管不同制絲工藝在相同加工工序中微生物群落豐富度不盡相同，但主要高豐富度微生物類群的種類比較一致；此外，煙葉在不同城市的不同儲(chǔ)存時(shí)間下，微生物類群的變化具有類似的趨勢(shì)。[結(jié)論]該研究對(duì)從微生物角度改進(jìn)煙葉制絲工藝具有一定的借鑒意義，同時(shí)表明煙葉的儲(chǔ)存時(shí)間可能是影響微生物后期群落發(fā)生變化的主要因素。

關(guān)鍵詞制絲工藝；高通量測(cè)序；微生物群落結(jié)構(gòu)；煙葉品質(zhì)

中圖分類號(hào)TS452文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0015-04

Effects of Cigarette Processing and Storage Process on Bacterial Community Structure

CHEN Xing1，YANG Ying1，LI Shanhui2，3 et al（1.Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650231；2.School of Life Science，Sun YatSen University，Guangzhou ，Guangdong 510275；3.Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming ，Yunnan 650091）

Abstract[Objective]In order to study the changes of bacterial community structure and diversity in cigarette processing and storage process [Method]The two generation highthroughput sequencing platforms were used to study the processing technology of Yunyan tobacco （R） and the surface microorganism of tobacco leaves during storage.The 16S rRNA gene was sequenced by highthroughput sequencing.[Result]Although different technics in the same processing in the process of microbial community richness was not the same，but the main types of high richness microbial communities were consistent.In addition，the results also showed that the storage time of tobacco leaves could be the main factor affecting the changing of microbial community rather than the cities where they storage.[Conclusion]The study has a certain reference significance for improving tobacco processing technology from microorganism angle.Meanwhile，it indicates that the storage time of tobacco leaves may be the main factor that affects the later stage of microbial community.

Key wordsCigarette processing；Highthroughput sequencing；Microbial community structure；Tobacco quality

卷煙是用特定的技術(shù)和設(shè)備將煙草原料和輔助材料加工制作成消費(fèi)者可吸食商品的過(guò)程。根據(jù)煙葉原料的性質(zhì)，卷煙生產(chǎn)的工藝流程是通過(guò)各種加工方法或設(shè)備逐步把煙葉原料和其他輔助材料制成合格卷煙產(chǎn)品所必須經(jīng)過(guò)的加工制造過(guò)程。該流程包括的主要工藝除制絲外，還包括卷接和包裝。有研究表明，煙葉在生長(zhǎng)和調(diào)制過(guò)程中均有微生物在煙葉上生長(zhǎng)，其微生物種類和數(shù)量會(huì)隨著煙葉品種、產(chǎn)地、等級(jí)、調(diào)制方式的不同而存在一定差異。對(duì)于煙葉表面微生物群落的研究始于1933 年，Reid等[1]首次發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉表面具有大量的細(xì)菌和霉菌，其主要的細(xì)菌類群是巨大芽孢桿菌，而主要的霉菌類群為曲霉和青霉。Tamayo等[2]從西班牙煙葉中分離出的微生物主要是球菌和芽孢桿菌。謝和等[3]從烤煙中分離到了放線菌、細(xì)菌和霉菌，但未發(fā)現(xiàn)酵母菌。邱立友等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，烤煙NC89在自然醇化過(guò)程中煙葉表面存在著占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌和數(shù)量較少的霉菌和放線菌。王革等[5]在國(guó)內(nèi)初次從自然發(fā)酵的煙葉上分離到酵母菌。研究結(jié)果均表明，發(fā)酵煙葉表面微生物群落的多樣性較豐富，盡管細(xì)菌、霉菌和酵母菌等均有存在，但以細(xì)菌群落為主，且細(xì)菌中的芽孢桿菌所占的豐富度較高。煙葉品質(zhì)發(fā)生復(fù)雜變化的主要特征是煙葉中化合物的分解與轉(zhuǎn)化，其中影響煙葉香氣和吸味品質(zhì)的重要過(guò)程是將不具備香味特性的大分子物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、高級(jí)脂肪酸、纖維素、還原性糖和煙堿等化合物，轉(zhuǎn)化為各種揮發(fā)性酸或揮發(fā)性香氣成分的小分子化合物[6]。此過(guò)程中，微生物在煙葉品質(zhì)和口味的改變過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，對(duì)于煙葉加工及儲(chǔ)存運(yùn)輸過(guò)程煙葉表面微生物多樣性研究較少，這就使得實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中缺乏科學(xué)依據(jù)。

筆者通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，以卷煙加工及儲(chǔ)存中的不同過(guò)程下的細(xì)菌群落為研究對(duì)象，對(duì)其組成及變化進(jìn)行研究，以期通過(guò)對(duì)烤煙煙葉表面微生物進(jìn)行全面、系統(tǒng)的認(rèn)知，充分了解煙葉品質(zhì)變化過(guò)程中烤煙煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，從而認(rèn)知微生物群落變化與煙葉品質(zhì)改變之間的關(guān)系，為煙葉品質(zhì)的調(diào)控和微生物資源的挖掘提供科學(xué)指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料及設(shè)計(jì)

該試驗(yàn)所用到的云煙（軟珍，代號(hào)R）卷煙由云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。根據(jù)制絲工藝的不同，分為薄板模塊（代號(hào)B）和氣流模塊（代號(hào)Q），所有樣品均來(lái)自這2個(gè)卷煙制絲工藝的各個(gè)加工工序，樣品信息如表1所示。

表1中原料煙葉（代號(hào)01）是指陳化完成后待加工的片狀煙葉，片狀煙葉經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的陳化過(guò)程被擠壓成塊狀，這個(gè)時(shí)期的煙葉水分含量較少。在松散回潮工序（代號(hào)02）中，煙葉在加入水蒸氣后充分吸收水分而變得松軟，然后通過(guò)機(jī)械的方式把結(jié)成塊狀的煙葉抖散，煙葉充分分散之后開(kāi)始進(jìn)入加料工序。制絲過(guò)程中加料分2次進(jìn)行（一加入口，代號(hào)03；一加出口，代號(hào)04；二加入口，代號(hào)05；二加出口，代號(hào)06），料液的加入使煙葉的耐加工性能和感官品質(zhì)提高。儲(chǔ)存柜的作用是待加料工序完成后，煙葉在儲(chǔ)柜中儲(chǔ)存，使料液和煙葉充分作用。煙葉從櫥柜取出后（代號(hào)07），煙葉經(jīng)過(guò)切絲工序后進(jìn)入烘絲工序。烘絲完成后（代號(hào)08），再經(jīng)過(guò)冷卻后（代號(hào)09），最終進(jìn)入添加香精香料的加香工序。

研究所用R牌號(hào)卷煙的儲(chǔ)存方式根據(jù)城市的不同和放置時(shí)間的不同進(jìn)行取樣，并以剛剛包裝成型的卷煙產(chǎn)品作為對(duì)照，具體樣品信息如Rcontrol*（對(duì)照），RM01*、RM02*、RM03、RM04、RM05、RW01*、RW02*、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02*、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02*、RK03、RK04、RK05。樣品制備和采集時(shí)均帶一次性無(wú)菌聚乙烯（PE）手套進(jìn)行操作，取樣完成后，立即用無(wú)菌封口袋包扎密封，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)于不同城市放置不同時(shí)間的未拆封卷煙產(chǎn)品樣品分別來(lái)自牡丹江市（代號(hào)M）、烏魯木齊市（代號(hào)W）、?？谑校ù?hào)H）和昆明市（代號(hào)K），在各個(gè)城市的放置時(shí)間分別為7 d（代號(hào)01）、30 d（代號(hào)02）、120 d（代號(hào)03）、180 d（代號(hào)04）和360 d（代號(hào)05），“*”代表樣品是由Roche 454 GS FLX+平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，而其余樣品在Illumina Miseq平臺(tái)下測(cè)序。

1.2方法

1.2.1樣品表面微生物的收集及宏基因組DNA的提取。

參考2009年Zhao等煙葉表面微生物的收集方法[7]，根據(jù)煙葉的實(shí)際情況作了部分改良，且所有步驟均保證在無(wú)菌條件下進(jìn)行。DNA的提取采用土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation kit，code：12888-100）對(duì)收集的各個(gè)煙葉表面微生物樣品進(jìn)行DNA提取，提取過(guò)程參照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化[8]。

1.2.216S rRNA基因PCR擴(kuò)增及測(cè)序。

該研究中，所有PCR擴(kuò)增引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。對(duì)于Roche 454 GS FLX+平臺(tái)測(cè)序的樣品，采用融合barcode序列的V6F3引物（5′CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGbarcodeTGCAACGCGAAGAACCTTACC3′）和V8R2引物（5′CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCCCGGGAACGTATTCACCG3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L） 0.5 μL；Primer R （50 μmol/L）0.5 μL；Plantium Taq（5 U/μL） 0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反應(yīng)條件如下所示： 94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min；10 ℃、 ∞。

對(duì)于在Illumina Miseq 300PE平臺(tái)測(cè)序的樣品，采用融合barcode序列的引物341F（5′CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNbarcodeCCTACGGGNGGCWGCAG3′）和805R（5′GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC3′）。PCR反應(yīng)體系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L）1.0 μL；Primer R （50 μmol/L）1.0 μL；Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反應(yīng)條件如下所示： 94 ℃、30 s；94 ℃、20 s，45 ℃、20 s，65 ℃、60 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min；10 ℃、∞。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)后，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（code： SK8131）對(duì)DNA進(jìn)行純化回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因高通量測(cè)序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析。

該研究中Roche 454 GS FLX+平臺(tái)和Illumina Miseq 300PE平臺(tái)測(cè)序所得的序列主要通過(guò)QIIME[9]軟件來(lái)進(jìn)行分析。采用QIIME中的“split_libraries.py”命令根據(jù)barcode序列對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分，并刪除低質(zhì)量序列：①序列長(zhǎng)度小于200或大于1 000個(gè)堿基；②序列中存在6個(gè)及以上的模糊堿基；③測(cè)序時(shí)Q值的平均值低于25；④序列中存在的單堿基重復(fù)超過(guò)6個(gè)；⑤前端的barcode序列有1個(gè)及以上堿基的錯(cuò)配；⑥引物序列有1個(gè)及1個(gè)以上堿基錯(cuò)配。高質(zhì)量序列通過(guò)uclust[10]的方法在97%相似度的水平上對(duì)所有樣品進(jìn)行OTU劃分，并選取代表序列利用blast[11]方法與Greengenes[12]數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得分類學(xué)信息。

2結(jié)果與分析

2.1卷煙加工過(guò)程中細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1薄板制絲工藝中細(xì)菌群落的組成及變化。

在云煙（軟珍）薄板制絲工藝各加工工序樣品（RB01～09）中，共獲得高質(zhì)量序列95 603條，平均每個(gè)樣品包含10 622條有效序列。所有序列共被注釋到了包含12個(gè)已知的菌門在內(nèi)的16個(gè)菌門中（圖1），其中包括以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）為主要豐富度的微生物類群，還包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、梭桿菌門（Fusobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、螺旋體門（Spirochaetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），此外，還有3個(gè)分類地位不明確類群（OD1、OP10和TM7）以及未被分類類群（Unclassified bacteria）。在12個(gè)已知門類的微生物類群中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）的平均序列量分別占到云煙（軟珍）薄板制絲工藝各加工工藝所有樣品細(xì)菌類群的總注釋序列量的59.2%、24.9%、6.5%和8.8%?？梢?jiàn)，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）這2個(gè)菌門在煙葉處理過(guò)程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成中為主要優(yōu)勢(shì)類群。對(duì)比薄板制絲工藝不同階段的優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度的變化，結(jié)果表明，隨著薄板制絲工藝加工過(guò)程的不同，細(xì)菌群落的組成豐度也顯著變化，變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度大體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，而厚壁菌門（Firmicutes）卻呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢(shì)。

2.1.2氣流制絲工藝中細(xì)菌群落的組成及變化。

在云煙（軟珍）氣流制絲工藝各加工工序樣品（RQ01～09）中，共獲得高質(zhì)量序列113 995條，平均每個(gè)樣品包含12 666條有效序列。所有序列共被注釋到了包括21個(gè)已知的菌門中（圖2），主要包括優(yōu)勢(shì)門類：變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），以及酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠菌門（Chlorobi）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae），硝化螺旋菌門（Nitrospira）、螺旋體門（Spirochaetes）和熱袍菌門（Thermotogae），此外還有6個(gè)分類地位不明確類群（TM7、Bacteria_incertae_sedis、BRC1、OD1、OP10和WS3）和未被分類類群（Unclassified bacteria）。和薄板制絲工藝類似，變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為云煙（軟珍）氣流制絲工藝各加工工序樣品中的主要優(yōu)勢(shì)菌群，分別占總序列數(shù)的46.2%、32.3%、9.9%和8.4%；此外，氣流制絲工藝中擬桿菌門（Bacteroidetes）占總序列量的1.1%。

2.2不同放置形式下的煙葉表面微生物結(jié)構(gòu)分析

在不同城市放置不同時(shí)間下的云煙（軟珍）產(chǎn)品（Rcontrol、RM01、RM02、RM03、RM04、RM05、RW01、RW02、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02、RK03、RK04、RK05）在門一級(jí)水平上，所有序列共被注釋到了24個(gè)門，其中包括以厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為主的優(yōu)勢(shì)菌門，還包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、嗜熱絲菌門（Caldiserica）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等。此外，還有4個(gè)分類地位不明確類群（OD1、OP10、TM7和Bacteria_incertae_sedis） 和未被分類類群（Unclassified bacteria）。具體物種相對(duì)豐度如圖3所示。

3結(jié)論與討論

高通量測(cè)序技術(shù)是目前微生物多樣性研究應(yīng)用最為廣泛高效的方法[13]。該研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同制絲工藝的卷煙及其運(yùn)輸過(guò)程中煙葉表面微生物多樣性進(jìn)行研究，每個(gè)樣品平均獲得12 842條高質(zhì)量序列，劃分為21個(gè)已知門類。對(duì)不同制絲工藝及不同運(yùn)輸過(guò)程煙葉表面微生物群落的研究均表明，包括變形菌門（Proteobacteria）、藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），以及放線菌門（Actinobacteria）在內(nèi)的類群為主要微生物門類。已有研究表明，發(fā)酵煙葉表面微生物多樣性較為豐富，且以細(xì)菌為主，其中芽孢桿菌類群較為豐富，這與該研究所得宏基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。韓錦峰等[14]研究表明，葉面微生物數(shù)量會(huì)隨著人工發(fā)酵和自然醇化而逐漸減少。雷麗萍等[15]對(duì)煙葉生長(zhǎng)和晾制階段細(xì)菌種群的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)白肋煙在晾制過(guò)程中，煙葉干燥速度和相對(duì)濕度與細(xì)菌總量的變化密切相關(guān)。該研究表明，隨著加工工藝的改變和儲(chǔ)存地域及時(shí)間的變化，煙葉表面微生物的類群和豐度不斷發(fā)生變化，但主要類群的種類相對(duì)穩(wěn)定。制絲工藝作為卷煙生產(chǎn)過(guò)程中至關(guān)重要一環(huán)，對(duì)其表面微生物群落研究表明，云煙（軟珍）卷煙在薄板和制絲工藝下，各加工工序中煙葉表面細(xì)菌類群的變化具體表現(xiàn)為：不同的制絲工藝中優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度有明顯差異，主要原因可能與原料煙葉的品質(zhì)不同有關(guān)，也充分說(shuō)明了煙草煙葉表面微生物的數(shù)量和種類隨煙葉品種、產(chǎn)地、等級(jí)及加工方式的不同而存在一定差異[14-17]。在同一制絲工藝下，隨著加工工序的不斷進(jìn)行，優(yōu)勢(shì)類群的相對(duì)豐度也在逐漸發(fā)生變化，這可能是不同加工工序的處理導(dǎo)致了外界環(huán)境因子（如溫度和濕度等）的不斷變化，從而影響了煙葉表面細(xì)菌的生理機(jī)能，而不同的微生物類群具有不同的生理適應(yīng)性，因此產(chǎn)生了細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類群數(shù)量和種類上的變化，也可能是外界物質(zhì)進(jìn)入后直接與細(xì)菌類群發(fā)生作用而影響其群落結(jié)構(gòu)；不同制絲工藝的相同加工工序中優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度同樣具有明顯差異，可能因?yàn)楸“搴蜌饬?種不同的制絲工藝的處理在影響著煙葉表面的群落結(jié)構(gòu)，也可能因?yàn)樵蠠熑~自身所攜帶的細(xì)菌類群的種類和數(shù)量就不同，因此導(dǎo)致了這種差異的形成。盡管2種制絲工藝中微生物群落的變化沒(méi)有明顯趨勢(shì)，但在二加入口的樣品（RB05和RQ05）中，放線菌類群豐度均明顯增多，這可能是由于隨著松散回潮之后，微生物與外界空氣接觸充足，消耗煙葉中的糖類、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物質(zhì)，使得環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極度下降，而對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)的放線菌豐度顯著升高。在這個(gè)過(guò)程中，蛋白質(zhì)的消耗可以有效減少因蛋白質(zhì)含量過(guò)多而產(chǎn)生的惡臭味[18]；糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類、脂類、單萜類等小分子化合物可以產(chǎn)生一定香氣[19-23]；纖維素的減少可以有效減少煙葉的辛辣和刺激性[24]。因此，在此過(guò)程中很有可能是微生物影響煙葉品質(zhì)（包括口感和氣味）的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)不同城市放置時(shí)間的煙葉表面微生物研究表明，除昆明之外，不同城市的煙葉在放置7 d后，微生物類群與對(duì)照的變化基本不大，且隨著時(shí)間的變化，不同城市放置的煙葉表面主要微生物群落豐度的變化大體一直，也就是說(shuō)，相對(duì)于時(shí)間因素來(lái)講，空間地理因素可能不是影響煙葉微生物主要類群豐度變化的主要原因。煙葉品質(zhì)的改變，可能隨放置的時(shí)間不同而逐漸改變。

總之，該研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解析了煙葉在不同制絲工藝加工及儲(chǔ)存過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在一加出口和二加入口的過(guò)程中可能是與煙葉品質(zhì)相關(guān)的重要階段，為微生物制劑指導(dǎo)煙葉加工工藝提供理論借鑒。此外，研究還表明，在儲(chǔ)存過(guò)程中，煙葉的儲(chǔ)存時(shí)間可能是影響煙葉表面微生物群落變化的主要因素，而其所在地理位置環(huán)境對(duì)煙葉的影響不大。

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