潘媛+陳大霞+宋旭紅+張雪+李隆云

[摘要] 該研究應(yīng)用新一代測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeq^TM4000在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)藥用植物玄參根部進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)方法開展基因功能注釋和SSR位點(diǎn)搜索。通過測(cè)序，共獲得65 602 036條原始序列。利用生物信息學(xué)軟件拼接和組裝序列，獲得73 983條unigene，平均長度823 bp。序列同源性比較表明，56 389條unigene與其他物種具有不同程度的同源性。通過Swiss-Prot，GO，KEGG，COG比對(duì)注釋，發(fā)現(xiàn)520條編碼玄參次生代謝途徑關(guān)鍵酶基因和191個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。利用MISA軟件在所有unigenes中共搜索到11 659個(gè)SSR位點(diǎn)，重復(fù)類型以二核苷酸為主。該研究所獲得的參與次生代謝的關(guān)鍵基因可為研究玄參藥用成分的生物合成和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)，獲得的大量SSR位點(diǎn)為后續(xù)研究玄參種質(zhì)鑒定及遺傳多樣性研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 玄參；轉(zhuǎn)錄組；高通量測(cè)序；萜類物質(zhì)

[Abstract] To investigate the profile of gene function and search for SSR， a new technology of high-throughput Solexa / Illumina sequencing was used to generate the root transcriptome of Scrophularia ningpoensis， and 65 602 036 raw reads were obtained. Based on the bioinformatics analysis and Trinity， 73 983 unigenes were obtained with an average length of 823 bp. The comparison of sequence homology in database showed that 56 389 unigenes had different degrees of homology. A total of 520 metabolic pathways related genes and 191 related transcription factors were identified by the Swiss-Prot， GO， KEGG and COG.The 11 659 SSRs were found by MISA and the highest frequency was AG/CT. In this study， we obtained numerous SSRs to provide references for the study of functional gene cloning and genetic diversity of S. ningpoensis. The key genes involved in the secondary metabolism are the basis for the study of biosynthesis and regulatory mechanism of the secondary metabolites.

[Key words] Scrophularia ningpoensis；transcriptome；high throughput sequencing；terpenoids

玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。玄參為我國常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，歷代藥典都有收載。味甘、苦、咸、微寒，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)等功效[1]。研究發(fā)現(xiàn)玄參含有環(huán)烯醚萜、苯丙素、多糖等多種化學(xué)成分，具有保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗炎、增強(qiáng)免疫等藥理活性[2]。長期以來，由于玄參分子生物學(xué)相關(guān)研究起步較晚，缺乏玄參生長發(fā)育相關(guān)的分子標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建以及次生代謝途徑等基礎(chǔ)性研究成果的支撐，玄參分子育種、藥效成分合成研究進(jìn)展緩慢。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為研究玄參生長發(fā)育及次生代謝的分子機(jī)制提供了重要的基因資源，并為開展玄參功能基因組學(xué)研究提供了全新的思路和方法[3-4]。

高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物體轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析，采用該技術(shù)能全面快速地獲取研究對(duì)象在某一狀態(tài)下基因轉(zhuǎn)錄信息，從中挖掘重要功能基因，揭示不同生物學(xué)性狀的分子機(jī)制[5-7]。開展玄參轉(zhuǎn)錄組的研究，也可能發(fā)現(xiàn)一些與其藥效活性成分生物合成相關(guān)的候選基因，為玄參藥效資源的充分利用奠定基礎(chǔ)。本研究擬在轉(zhuǎn)錄水平上，利用Illumina HiSeq^TM4000測(cè)序技術(shù)構(gòu)建玄參根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得玄參轉(zhuǎn)錄本信息，并進(jìn)行功能注釋及SSR位點(diǎn)分析，揭示玄參根系轉(zhuǎn)錄組的整體表達(dá)特征，為進(jìn)一步揭示玄參有效成分的累積、道地性形成等生物學(xué)過程的分子生物學(xué)研究提供豐富的數(shù)據(jù)資源。

1 材料與方法

1.1 樣品 藥用植物玄參塊根采自重慶市武隆縣仙女山玄參GAP種植基地，采集時(shí)間為2015年8月初（塊根膨大期），經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為玄參科玄參屬植物玄參S. ningpoensis。選擇生長健壯無病害的玄參植株，純水洗凈整個(gè)塊根，用滅菌后的吸水紙吸干表面水分，迅速將塊根切成約5 mm厚的薄片，立即用液氮速凍，后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 采用 Trizol Reagent （Invitrogen）法提取玄參根總RNA，使用Agilen2100生物分析儀和NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)提取的總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)?？俁NA質(zhì)檢合格后，用帶有Oligo （dT）的磁珠富集真核生物mRNA加入fragmentation buffer，將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用6堿基隨機(jī)引物（random hexamers）反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ合成雙鏈cDNA鏈，經(jīng)過QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加poly （A）并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小篩選，接著進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq^TM4000進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)的拼接與組裝 經(jīng)測(cè)序獲得的原始序列（raw reads），去除里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，從而獲得干凈序列（clean reads）。本研究采用Trinity[8]對(duì)clean reads進(jìn)行拼接。該軟件通過序列之間的重疊（overlap）信息組裝得到重疊群（contigs），然后局部組裝得到轉(zhuǎn)錄本（transcripts），最后用 TGICL和 Phrap 軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行同源聚類和拼接得到單基因簇（unigene）。

1.4 功能注釋與分類 通過blastx將拼接所得unigene比對(duì)到Nr[10]（Non-redundant protein database，非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫），Nt，Swiss-Prot（SwissProt protein database，蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫），GO[11]（Gene Ontology，基因本體論數(shù)據(jù)庫）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，東京基因與基因組百科全書）和COG（Cluster of Orthologous Groups，蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫） （e-value<10^-5），從而獲得該unigene的功能注釋信息[9]和分類信息，對(duì)所有注釋信息進(jìn)行整理。

1.5 SSR位點(diǎn)篩選 將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用MISA 軟件進(jìn)行SSR分析。設(shè)置參數(shù)如下：總重復(fù)序列長度不低于20 bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸至少重復(fù)次數(shù)分別為10，7，5，4，4 [14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)組裝 采用Illumina HiSeq^TM4000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玄參根系轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，共得到6 560萬條raw reads以及6 456萬條clean reads。本研究clean reads Q20為97%（一般為>90%），GC量為44.82%，基本呈正態(tài)分布，質(zhì)量合格。采用Trinity軟件組裝共產(chǎn)生109 260個(gè)轉(zhuǎn)錄本，平均長度為493 nt。一般把所有轉(zhuǎn)錄本中最長的一個(gè)視為unigene，共獲得了73 983個(gè)unigene，長度201～15 502 nt，見表1。

2.2 序列功能注釋與分類 使用BLAST程序?qū)⒔M裝得到的unigene與NT，NR，KOG，GO，Swissprot，KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行unigene的序列相似性分析，從而得到該unigene的蛋白質(zhì)功能注釋信息。其中，匹配到 NR數(shù)據(jù)庫中的有56 389條，占全部unigene的76.21%，其后依次是Swissprot（56.44%），Nt（55.9%），GO（50.47），KO（31.05%），KOG（21.97%）。對(duì)這6種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行拓?fù)浞治?，共? 494條unigene在所有數(shù)據(jù)庫中同時(shí)標(biāo)注成功，占總unigene數(shù)的12.83%，并且在所有數(shù)據(jù)庫中至少有1種數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigene有58 948條，占總unigene數(shù)的79.67%。

以 NR 數(shù)據(jù)庫為例進(jìn)行分析，56 389條unigenes在NR數(shù)據(jù)庫中可找到相似序列。注釋基因同源序列的物種分布情況見圖1，在相似序列匹配度較高的近緣物種中，芝麻Sesamum indicum所占比例最高，為71.5%；其次是合瓣花Erythranthe guttata所占比例為14.0%，這些物種都為本研究中的序列注釋提供了參考序列。

將玄參Unigene與KOG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，可預(yù)測(cè) unigene功能并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。結(jié)果表明，共有16 126條 unigene（14.66%）被注釋到26種KOG分類中，見圖2。從圖中可以看出unigene涉及的KOG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng)。如RNA加工與修飾、能量的合成與運(yùn)輸、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、染色體結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)等。其中，“翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)”是最大類別，包含2 233條unigene，結(jié)合GO數(shù)據(jù)庫對(duì)玄參根系的unigene進(jìn)行功能分類，可從宏觀上認(rèn)識(shí)玄參根系表達(dá)基因的功能分布特征。試驗(yàn)結(jié)果表明，有 37 346條unigene被注釋到GO分類，其中參與生物學(xué)過程（biological process）分類中主要聚集于細(xì)胞過程（cellular process，21 126個(gè)），代謝過程（metabolic process，19 743個(gè)）和生物調(diào)節(jié)（biological regulation，7 192個(gè)）；在細(xì)胞組分（cellular component） 主要聚集于細(xì)胞 （cell，9 369個(gè)）、細(xì)胞成分（cell part，9 364個(gè)）和細(xì)胞器（organelle，7 780個(gè)）；在分子功能（molecular function）分類中主要聚集于結(jié)合蛋白（binding，21 810個(gè)）和催化活性（catalytic activity，16 641個(gè)），見圖3。

2.3 序列代謝通路分析 根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫的注釋信息能進(jìn)一步得到unigene的代謝通路注釋。本研究將unigene根據(jù)參與的KEGG代謝通路分為5個(gè)分支：細(xì)胞過程（A），環(huán)境信息處理（B），遺傳信息處理（C），代謝（D）和有機(jī)系統(tǒng)（E），其中涉及較多的有遺傳信息處理中的翻譯（2 096個(gè)）、折疊、分類和降解（1 897條），涉及最少的是環(huán)境信息處理中的膜轉(zhuǎn)運(yùn)（91條），見圖4。

結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫，對(duì)玄參根系的 unigene 可能參與或涉及的代謝途徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，22 972條unigene參與到129個(gè)代謝通路中，與玄參次生代謝相關(guān)的unigene有782條。主要代謝產(chǎn)物有16種，這些代謝產(chǎn)物分別為花青素（anthocyanin）、咖啡因（caffeine）、黃酮和黃酮醇（flavone and flavonol）、類黃酮（flavonoid）、芥子油苷（glucosinolate）、異黃酮（isoflavonoid）、異喹啉類生物堿（isoquinoline alkaloid）、苯丙素（phenylpropanoid）、類固醇（steroid）、生物素（biotin）、油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid）、類胡蘿卜素（carotenoid）、萜類化合物（terpenoid）、檸檬烯和蒎烯（limonene and pinene）和玉米素（zeatin）。玄參藥用成分主要有環(huán)烯醚萜類、苯丙素、多糖、部分黃酮類等，其中注釋到萜類、苯丙素類、黃酮類物質(zhì)生物合成與代謝途徑的unigene分別有56，249，52條，見圖5。

2.4 玄參次生代謝途徑相關(guān)基因的挖掘 環(huán)烯醚萜類、苯丙素類是玄參的主要藥用成分，它們的生物合成和代謝涉及到細(xì)胞色素P450、DXR-1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase）、FPPS-法呢基焦磷酸合成酶（farnesyl pyrophosphate synthase ）、HMGS-3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyglutaryl-CoA）及HMGR-HMG-CoA還原酶等酶的作用[15]，以上提到的酶都存在于玄參根中，其中編碼細(xì)胞色素P450家族相關(guān)酶的unigene共搜索到504條，編碼1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶的unigene共搜索到9條，法呢基焦磷酸合成酶共搜索到1條，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 和HMG-CoA還原酶各搜索到3條，見表2。

轉(zhuǎn)錄因子也稱反式作用因子，是能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用原件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過他們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉(zhuǎn)錄。本研究使用iTAK軟件對(duì)玄參轉(zhuǎn)錄組序列信息進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有3 919條unigene分屬于72個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。目前發(fā)現(xiàn)的植物萜類轉(zhuǎn)錄因子主要包括AP2/ERF類、WRKY類、鋅指類、bZIP類、bHLH類等[15]。在玄參轉(zhuǎn)錄組信息中與萜類合成相關(guān)的AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度最高，涉及到的unigene有191條，見圖6。AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，AP2/ERF家族成員在結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)或多個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。每個(gè)AP2/ERF結(jié)合域有2個(gè)保守序列塊—YRG原件和RAYD原件[16-18]。該轉(zhuǎn)錄因子已從擬南芥、煙草、水稻、玉米等多種植物中分離獲得，他們?cè)谥参锏纳L、發(fā)育、各種生物和非生物脅迫以及多種生理生化反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外，WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度也較高，它是近年來新發(fā)現(xiàn)的植物特有的鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能夠調(diào)控植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生理生化過程，調(diào)控植物次生代謝途徑中編碼關(guān)鍵酶基因的活性，并在植物抗病及免疫方面具有重要作用[19-20]。這些轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)將有助于玄參次生代謝成分生物合成途徑的進(jìn)一步研究。

2.5 SSR位點(diǎn)分析 SSR，簡單重復(fù)序列標(biāo)記（simple sequence repeats），又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星標(biāo)記，是一類由幾個(gè)核苷酸（1～6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長度較短，且廣泛均勻分布于真核生物基因組中。由于重復(fù)單位的核苷酸不同以及重復(fù)次數(shù)不完全相同，造成了SSR長度的高度變異性，其中最常見的雙核苷酸重復(fù)類型，如（CA）n。一般采用SSR分子標(biāo)記法對(duì)物種種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。本實(shí)驗(yàn)利用MISA軟件在玄參根系的73 983條unigenes中共搜索到11 659個(gè)SSR位點(diǎn)，其中10 022條序列都存在SSR位點(diǎn)。SSR 的類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在，所占比例變化較大，見表3。其中，二核苷酸重復(fù)所占比例最高，達(dá)到了40.13%；比例最低的是五核酸重復(fù)，僅為 0.20%；單核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)所占比例大致相當(dāng)，分別為30.46%，27.87%。在檢測(cè)結(jié)果中，共出現(xiàn)61種基序類型，出現(xiàn)頻率最高的6類基序?yàn)椋篈G/CT（2475），AT/AT（1316），AC/GT（885），ATC/ATG（692），AAG/CTT（590）和ACC/GGT（572）。上述 SSR 特征分析，有助于開展玄參及其同屬物種的基因組差異分析、分子標(biāo)記開發(fā)和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的研究。

3 討論

目前，高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥用植物轉(zhuǎn)錄組分析中。本研究首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玄參根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和功能分析，深一步挖掘其次生代謝相關(guān)基因，填補(bǔ)了玄參轉(zhuǎn)錄組信息的空白。測(cè)序數(shù)據(jù)采用Trinity軟件共拼接得到73 983條unigene，平均序列長度823 bp，約73%的reads參與了拼接，拼接的N50長度為1 546 bp，所測(cè)得的unigene數(shù)量基本涵蓋了全部轉(zhuǎn)錄組信息。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控合格，測(cè)序質(zhì)量良好。獲得如此大的序列信息量，表明高通量測(cè)序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)玄參功能基因的有效手段。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)拼接序列進(jìn)行注釋和功能分類，其中56 389條unigene在Blast、同源性搜索中得到注釋，注釋率達(dá)76.2%，剩下的17 594條unigene可能是由于長度較短而未與公共數(shù)據(jù)庫中的序列比對(duì)上，也可能是非編碼序列或者是新的基因[21]。

本研究通過同源搜索，共發(fā)現(xiàn)520條編碼玄參次生代謝途徑關(guān)鍵酶的相關(guān)基因和191個(gè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。這些基因的發(fā)現(xiàn)，為后續(xù)開展的玄參次生代謝物合成關(guān)鍵基因的鑒定和克隆提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。眾所周知，萜類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)合成較困難，目前主要以原植物提取獲得。因此，開展玄參次生代謝物合成關(guān)鍵酶基因及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控分子機(jī)制尤為重要，隨著后基因組工作的深入，這些關(guān)鍵基因?qū)⒆鳛楦脑熘参锎x途徑的有力工具，人為控制次生代謝物的合成量。本研究所獲得的轉(zhuǎn)錄組信息不光為玄參次生代謝物生物合成研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步開展玄參生長發(fā)育、抗病抗逆等相關(guān)分子機(jī)制研究提供可靠信息。

此外，與傳統(tǒng)測(cè)序方法相比，高通量測(cè)序技術(shù)操作簡單，能夠挖掘出大量的SSR位點(diǎn)信息。本研究發(fā)現(xiàn)玄參根SSR位點(diǎn)11 659個(gè)，重復(fù)類型以二核苷酸為主，占全部SSR的40.13%。這些SSR位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)可為玄參分子標(biāo)記的開發(fā)、群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、標(biāo)記輔助選擇、基因定位、親緣鑒定等方面的研究提供依據(jù)。

由于玄參未開展全基因組測(cè)序，可供參考的遺傳信息非常少，因此對(duì)玄參根轉(zhuǎn)錄組的特性分析還有待于進(jìn)一步的深入研究。本研究所獲得的玄參根轉(zhuǎn)錄組信息，一方面獲得大量SSR位點(diǎn)，為后續(xù)研究玄參的功能基因克隆及遺傳多樣性研究提供參考；另一方面獲得了豐富的參與次生代謝的關(guān)鍵基因，也為玄參藥用成分的生物合成和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]