蘭阿峰　楊曼　郭素芬

摘要[目的]了解野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的組成及其多樣性。[方法]提取野生秦嶺羚牛瘤胃內(nèi)容物總DNA，選用產(chǎn)甲烷菌特異性引物 Met86F和Met1340R，對(duì)總DNA進(jìn)行16S rRNA特異性擴(kuò)增，構(gòu)建秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA克隆文庫(kù)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR-RFLP（限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性）分析，并對(duì)Hae Ⅲ 酶切帶譜不同的菌液進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。[結(jié)果]根據(jù)酶切帶譜分析和測(cè)序結(jié)果的不同，將隨機(jī)挑取的105個(gè)陽(yáng)性克隆歸為14個(gè)不同的可操作分類(lèi)單元（OTUs）。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這些克隆序列均位于廣域古菌門(mén)（Euryarchaeota），隸屬甲烷桿菌科（Methanobacteriaceae，65.71%）、Methanomassiliicoccus（29.52%）和Methanosarcinaceae（4.76%）3個(gè)科。其中有57個(gè)序列與可培養(yǎng)菌相似度在97%以上，分屬于Methanobrevibacter millerae、Methanobrevibacter olleyae 和Methanobrevibacter thaueri。其余48個(gè)序列與未培養(yǎng)菌相似度較高，占11個(gè)OTUs。[結(jié)論]野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌多樣性比較豐富，且可能存在新的分類(lèi)單元。

關(guān)鍵詞野生秦嶺羚牛；瘤胃；產(chǎn)甲烷古菌；分子多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)S852.6；Q939文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0088-04

Study on the Diversity of Methanogenic Archaea in the Rumen of Wild Budorcas taxicolor bedfordi

LAN Afeng1，2，YANG Man1，GUO Sufen1 et al（1.School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001；2.Shaanxi Engineering Research Center of Edible and Medicated Fungi，Hanzhong，Shaanxi 723001）

Abstract[Objective] To investigate the composition and diversity of methanogenic archaea in the rumen of wild Budorcas taxicolor bedfordi.[Method]Total DNA was extracted from rumen content of wild B.taxicolor.A pair of methanogenic archaeas specific PCR primers were used for 16S rRNA specific amplification and a clone library was constructed for the DNA samples.Positive clones were analyzed by PCRrestriction fragment length polymorphism （PCRRFLP） and the clones with unique HaeⅢ patterns were selected for sequencing and constructing 16S rRNA gene phylogenetic tree.[Result] Based on HaeⅢ digestion and sequencing results，a total of 105 positive clones randomly screened from the library were classified into 14 operational taxonomic units （OTUs）.Phylogenetic analysis showed that these clone squences belonged to Euryarchaeota and they were divided into three families：Methanobacteriaceae，Methanomassiliicoccus and Methanosarcinaceae.The similarity between 57 sequences and cultured archaea was above 97% and they belonged to Methanobrevibacter millerae，Methanobrevibacter olleyae and Methanobrevibacter thaueri. Other 48 sequences had an higher similarity with uncultured archae，containing 11 OTUs.[Conclusion] The methanogenic archaea in the rumen of wild B.taxicolor had an abundant diversity methanogens and there might be a new taxon.

Key wordsWild Budorcas taxicolor bedfordi；Rumen；Methanogenic archaea；Molecular diversity

基金項(xiàng)目陜西理工學(xué)院人才引進(jìn)啟動(dòng)項(xiàng)目（SLGQD-8）。

作者簡(jiǎn)介蘭阿峰（1978—），男，陜西宜川人，講師，博士，從事腸道微生物多樣性研究。

收稿日期2017-11-13；修回日期2017-11-16

秦嶺羚牛（Budorcas taxicolor bedfordi），隸屬偶蹄目?？?，屬于國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，與大熊貓、金絲猴、朱鹮并稱(chēng)為“秦嶺四寶”[1]。野生秦嶺羚?？刹墒扯喾N植物，食物結(jié)構(gòu)豐富[2]。瘤胃是一個(gè)含有大量微生物的厭氧生態(tài)系統(tǒng)，在反芻動(dòng)物的食物消化與營(yíng)養(yǎng)代謝中起著非常重要的作用[3]。Wright等[4]研究表明反芻動(dòng)物瘤胃中含有細(xì)菌、古菌、原蟲(chóng)、真菌和病毒。瘤胃古菌主要是產(chǎn)甲烷菌（Methanogens），產(chǎn)甲烷菌在清除瘤胃發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氫氣方面扮演著重要角色，它能將氫氣、甲酸、乙酸等轉(zhuǎn)化成甲烷和CO2，并從中獲取能量[5]。目前瘤胃產(chǎn)甲烷菌的研究日益受到重視，對(duì)其分子多樣性的研究主要是通過(guò)古菌特異性引物進(jìn)行16S rRNA的克隆分析[6-8]。Wright等[7]以引物 Met86F和Met1340R 對(duì)西澳大利亞綿羊瘤胃的產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行克隆，發(fā)現(xiàn)Methanobrevibacter、Methanotorris 和Methanosphaera 3 個(gè)屬的產(chǎn)甲烷菌。裴彩霞等[8-9]以3對(duì)產(chǎn)甲烷菌引物對(duì)晉南牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)引物 Met86F和Met1340R 克隆較為全面，又利用該引物研究了山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌，發(fā)現(xiàn)甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）為優(yōu)勢(shì)菌群。

關(guān)于野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者采用引物Met86F和Met1340R對(duì)野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的16S rRNA 進(jìn)行克隆并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析其瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性，以期為瘤胃微生物多樣性的研究提供數(shù)據(jù)支持，也為更好地掌握瘤胃代謝和微生物相互之間的關(guān)系，為合理應(yīng)用飼料、開(kāi)辟新的飼料資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料。采集野生秦嶺羚牛瘤胃內(nèi)容物，凍存于-80 ℃冰箱待用。

1.1.2主要儀器和試劑。凝膠掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-rad）、高速冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5424R，德國(guó)Eppendorf）、PCR擴(kuò)增儀（TC4000，英國(guó)TECHNE）、核酸測(cè)定儀（Bio Photometer plus，德國(guó)Eppendorf）、美國(guó)Mo Bio公司Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、pMD19-T Vector （TaKaRa）、Sanprep 柱式DNA膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物快速克隆試劑盒、Taq DNA 聚合酶、PCR引物、X-gal、IPTG等試劑均購(gòu)自上海生工。

1.2瘤胃產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建

1.2.1材料的獲得。試驗(yàn)材料取自陜西省佛坪自然保護(hù)區(qū)，通過(guò)胃管采集野生秦嶺羚牛瘤胃內(nèi)容物，凍存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2總DNA提取。總DNA的提取按照Ultra Clear Fecal DNA Isolation Kit提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.316S rRNA擴(kuò)增。產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA通用引物的選擇參考裴彩霞等[8-9]和Wright等[10]的研究，采用引物 Met86F（5'-GCTCAGTAACACGTGG-3'）和Met1340R（5'- CGGTGTGTGCAAGGAG -3'）進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度在1 260 bp左右（含引物長(zhǎng)度）。PCR反應(yīng)體系（50 μL）如下：2×Taq Master Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板DNA 4 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，共 34個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4克隆文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選。Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒將擴(kuò)增后1 260 bp左右的目的條帶切膠純化回收。純化產(chǎn)物與pMD-19T vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆子的初步篩選參照文獻(xiàn)[11]：將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布含氨芐青霉素（100 mg/L）、X-gal、IPTG的LB瓊脂平板37 ℃避光培養(yǎng)12～16 h 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.3PCR-RFLP分析

挑取陽(yáng)性克隆子用pMD19-T Vector載體通用引物M13-47和M13-48對(duì)插入片段進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)對(duì)目標(biāo)插入片段進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。菌落PCR體系（20 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 6 μL，菌液1 μL。菌落PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。利用限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ 對(duì)菌落PCR產(chǎn)物于37 ℃下酶切4 h，酶切體系（20 μL）如下：10×Buffer 2 μL、HaeⅢ 1 μL、PCR產(chǎn)物5 μL、ddH2O 12 μL。酶切產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。酶切圖譜用Quantity One軟件進(jìn)行分析，選取酶切帶型不同的代表克隆對(duì)應(yīng)的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行測(cè)通測(cè)序。將HaeⅢ 酶帶譜切分析不同且測(cè)序結(jié)果也不同的克隆歸為1個(gè)OTUs?？寺∥膸?kù)覆蓋率計(jì)算公式如下：C=[1-（n/N）]×100%[12]。式中，n代表在16S rRNA 克隆文庫(kù)僅出現(xiàn)一次的OTU數(shù)量，N代表16S rRNA克隆文庫(kù)的總數(shù)。

1.4克隆文庫(kù)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN 6.0軟件去除載體序列后提交到NCBI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行Blast檢索[13]，下載同源性較高的模式菌株的數(shù)據(jù)，生成Fasta格式文件。使用Clustal X軟件對(duì)所得序列進(jìn)行人工校正及比對(duì)分析。利用Mega 5軟件，按照Neighbor-Joining法聚類(lèi)選擇1 000個(gè)重復(fù)進(jìn)行Bootstrap值分析后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將所得16S rRNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，申請(qǐng)登陸號(hào)為KM103518～KM103520和KM073422～KM073435。

2結(jié)果與分析

2.1總DNA提取及16S rRNA特異性擴(kuò)增

提取野生秦嶺羚牛瘤胃內(nèi)容物總DNA，用產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA通用引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到約1 260 bp的目標(biāo)片段（圖1）。

2.2PCR-RFLP分析

從構(gòu)建的16S rRNA克隆文庫(kù)中隨機(jī)挑選150個(gè)陽(yáng)性克隆，以質(zhì)粒通用引物進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物（大于1 200 bp）用限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ 進(jìn)行插入目的片段的RFLP分析，挑選酶切帶譜不同的克?。ü?18個(gè)）送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序部測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果去除嵌合序列，并排除重復(fù)序列后共得到14個(gè)OTUs（代表105個(gè)有效序列）。根據(jù)公式，計(jì)算出克隆文庫(kù)的覆蓋率C為97.1%，可以代表野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的多樣性。

2.3產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析

選取不同酶切帶譜對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果可將105個(gè)陽(yáng)性克?。ㄈコ逗象w和重復(fù)序列）歸為14個(gè)OTUs。序列比對(duì)結(jié)果表明，這些序列均位于廣域古菌門(mén)（Euryarchaeota），分屬于Methanobacteriaceae、Methanomassiliicoccus和Methanosarcinaceae 3個(gè)科。54.29% （代表57個(gè)序列）的序列與可培養(yǎng)菌相似度在97%以上，分屬于Methanobrevibacter millerae（42個(gè)序列）、Methanobrevibacter olleyae（12個(gè)序列）和Methanobrevibacter thaueri（3個(gè)序列），相似度從99.00%到96.91%不等。另有48個(gè)序列與未培養(yǎng)菌相似度較高（與已培養(yǎng)菌的序列比對(duì)相似度低于未培養(yǎng)菌），分屬11個(gè)OTUs，其中1個(gè)OTUs（DQ445723）所占比例最高（33.33%，代表16個(gè)序列），這16個(gè)序列與DQ445723的相似度從97.27%到97.02%不等。在所有序列（105個(gè)序列）中，77個(gè)序列的比對(duì)結(jié)果相似度在97%以上，占總序列的73.33%（表1）。

根據(jù)產(chǎn)甲烷古菌16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。由圖2可知，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)共分為3支，其中一支與甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）聚在一起，未培養(yǎng)古菌G53和G98也聚在這一支；另一支為未培養(yǎng)古菌，未能確定種屬；G16單獨(dú)一支，與甲烷食甲基菌屬（Methanomethylovorans）聚在一起，代表可能有新的操作分類(lèi)單元。

3結(jié)論與討論

該研究獲得了野生秦嶺羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的16S rRNA序列，序列比對(duì)結(jié)果表明甲烷短桿菌屬為最優(yōu)勢(shì)菌群，占總克隆的54.29%，與裴彩霞等[9]的山羊瘤胃產(chǎn)甲烷桿菌的研究結(jié)果相一致[9]?？寺≈杏?8個(gè)序列與未培養(yǎng)菌相似度較高，占11個(gè)OTUs，未能確定種屬；另有一個(gè)OTUs在發(fā)育樹(shù)中形成獨(dú)立分支。

綜合比較目前的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，許多研究出現(xiàn)相同試驗(yàn)對(duì)象，不同試驗(yàn)所獲得的瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性不同，筆者認(rèn)為其結(jié)果主要是由以下原因造成的：①引物的不同造成克隆多樣性的不同。目前對(duì)瘤胃產(chǎn)甲烷菌的分子多樣性的研究對(duì)象主要有山羊[9，14]、綿羊[15-16]和奶牛[17-18]等。Tajima等[6]對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃產(chǎn)甲烷菌的多樣性進(jìn)行探究，結(jié)果表明引物0025cF/1429R較引物D30/D33探測(cè)到的產(chǎn)甲烷菌多樣性多。裴彩霞等[9]研究表明引物Met86F和Met1340R 克隆比其他2對(duì)引物（1Af/1100Ar和Archf364/Archr1386）較為全面。引物的不同導(dǎo)致克隆多樣性也有所區(qū)別。引物退火溫度及擴(kuò)增效率的不同，引物結(jié)合部位周?chē)慕Y(jié)構(gòu)以及不同擴(kuò)增模板的特性都會(huì)導(dǎo)致不同引物優(yōu)先擴(kuò)增的菌群不同，因而造成多樣性的差異。因此，對(duì)于羚牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的多樣性，還需用不同引物進(jìn)行研究。②動(dòng)物所采食日糧的不同，造成瘤胃內(nèi)微生物的組成不同[15，19]。日糧可能通過(guò)影響瘤胃發(fā)酵類(lèi)型等因素對(duì)瘤胃微生物多樣性和數(shù)量產(chǎn)生影響。該試驗(yàn)中羚牛是在陜西佛坪自然保護(hù)區(qū)內(nèi)自然放牧，取得瘤胃內(nèi)容物的時(shí)間是冬季，其野生狀態(tài)及取樣時(shí)間同樣是影響其瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌多樣性的重要因素。

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