張華 李興志 張雅婷
摘要[目的]構(gòu)建EV71病毒3C蛋白的真核表達(dá)載體,并驗(yàn)證其在細(xì)胞中的正確表達(dá)。[方法]采用RT-PCR技術(shù),從EV71病毒基因組RNA中擴(kuò)增3C基因,克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Flag上,并轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,通過Western blot和免疫熒光驗(yàn)證3C蛋白的表達(dá)。[結(jié)果]酶切及測序鑒定顯示,EV71病毒3C真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。Western blot和免疫熒光結(jié)果證實(shí)3C蛋白在HeLa細(xì)胞中成功表達(dá)。[結(jié)論]該研究成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.0-Flag-3C,為進(jìn)一步研究EV71病毒3C蛋白生物學(xué)功能奠定了一定基礎(chǔ)。
關(guān)鍵詞EV71病毒;3C蛋白;基因克?。惠d體構(gòu)建;蛋白表達(dá)
中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼
A文章編號0517-6611(2018)08-0097-03
Construction of pcDNA3.0-Flag-3C Plasmid and Its Expression of EV71 3C Protein in HeLa Cells
ZHANG Hua1,2,LI Xingzhi1,2,ZHANG Yating1,2 et al(1.College of Life Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163319;2.Biotechnology Center,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing,Heilongjiang 163319)
Abstract[Objective] To construct the eukaryotic expression vector of EV71 3C protein and investigate its expression in HeLa cells.[Method] Fragment of 3C was amplified from total RNA of EV71 genome and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag.After the recombination vector was transfected into HeLa cells,Western blot and indirect immunofluorescent assay were performed to confirm the 3C protein expression.[Result] Enzyme digestion and sequencing analysis showed that eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C was constructed correctly.The results of Western blot and indirect immunofluorescent indicated 3C protein was expressed in HeLa cells.[Conclusion] This research successfully constructed eukaryotic expression vector pcDNA3.0-Flag-3C, which might provide the foundation of research about the biological function of EV71 3C protein.
Key wordsEV71 virus; 3C protein; Gene clone; Vector construction;Protein expression
基金項(xiàng)目黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(12541578)。
作者簡介張華(1979—),男,湖北荊州人,副教授,博士,從事分子病毒學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者,教授,博士,從事分子病毒免疫與基因工程制藥研究。
收稿日期2017-12-07
口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,F(xiàn)MDV)是屬于小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒,F(xiàn)MDV病毒感染會引起偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病。研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)MDV病毒的致病性與其自身編碼的3C蛋白密切相關(guān),其具有幫助病毒自身復(fù)制、切割宿主蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、逃避宿主免疫監(jiān)視的重要生物學(xué)功能[1]。
在前期研究中,發(fā)現(xiàn)同屬小RNA病毒科的腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)同樣具有切割宿主因子[2],拮抗宿主天然免疫等現(xiàn)象[3]。有報(bào)道指出,EV71病毒的3C蛋白在病毒生命周期中發(fā)揮舉足輕重的作用[4],而抑制3C蛋白功能可以有效抑制病毒的復(fù)制[5],這些研究提示人們EV71病毒3C蛋白具有發(fā)揮類似FMDV病毒3C蛋白功能的可能性,但是諸多小RNA病毒科病毒在感染過程中,3C蛋白是否發(fā)揮相同的生物學(xué)功能尚不清楚。為了進(jìn)一步研究小RNA病毒科3C蛋白的功能是否具有普遍相似性,并嘗試解析3C蛋白的結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ),筆者構(gòu)建了EV71病毒3C蛋白真核表達(dá)載體,并進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證,以期為深入研究FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白功能的異同奠定一定的基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
HeLa細(xì)胞由分子病毒免疫與基因工程制藥實(shí)驗(yàn)室凍存復(fù)蘇;鼠單克隆抗Flag抗體和TRITC標(biāo)記的山羊抗鼠單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Invitrogen公司;質(zhì)粒抽提試劑盒購于Omega公司;Trizol試劑和LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司;引物合成和序列測定由Invitrogen完成;限制性核酸內(nèi)切酶BamH I和Hind Ⅲ、逆轉(zhuǎn)錄MLV酶和Ex Taq聚合酶購自TaKaRa公司;pcDNA3.0-Flag真核表達(dá)載體由分子病毒免疫與基因工程制藥實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建路線
根據(jù)NCBI GenBank網(wǎng)站所提供的基因序列(Accession No.:NM_006559),設(shè)計(jì)擴(kuò)增EV71病毒3C基因的引物,引物序列為
上游引物:5′-AAGCTTGGGCCCAGCTTAGACTTCGCCTTGT-3′(Hind Ⅲ);下游引物:5′-GAATTCCTTGCTCGCTGGCAAAATAACTCCTC-3′(BamH I)。
將EV71病毒3C插入pcDNA3.0-Flag質(zhì)粒的Hind Ⅲ/BamH I位點(diǎn),構(gòu)建載體的路線如圖1所示。
1.3EV71病毒3C基因的擴(kuò)增
首先采用Trizol試劑提取EV71病毒基因組RNA,使用MLV酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后使用PCR技術(shù)擴(kuò)增EV71病毒3C目的基因,反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,30個反應(yīng)循環(huán);72 ℃最后延伸5 min,切下目的條帶,膠回收,PCR產(chǎn)物測序。反應(yīng)體系為10×Buffer 5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4 μL,上游引物1 μL,下游引物1 μL,模板50~500 ng,Ex Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,ddH2O補(bǔ)足體系至50 μL,瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶進(jìn)行膠回收。
1.4pcDNA3.0-Flag-3C表達(dá)載體的構(gòu)建
分別用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH I雙酶切pcDNA3.0-Flag載體和EV71病毒3C片段。所用酶切體系分別為pcDNA3.0-Flag載體1 μg,Hind Ⅲ 1 μL,BamH I 1 μL,10×M Buffer 1 μL,ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL;PCR產(chǎn)物EV71病毒3C 1 μg,Hind Ⅲ 1 μL,BamH I 1 μL,10×M Buffer 1 μL,ddH2O補(bǔ)足體系至10 μL,瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物16 ℃進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,并涂布到含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑選克隆。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA,進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定及序列測定,鑒定正確的質(zhì)粒,命名為pcDNA3.0-Flag-3C。
1.5脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染前1 d將HeLa細(xì)胞接種至24孔板中,1×105細(xì)胞/孔,使細(xì)胞達(dá)90%~95%匯合度。用50 μL Opti-MEM稀釋質(zhì)粒DNA,輕輕混合,取2 μL LipofectamineTM2000用50 μL Opti-MEM稀釋,輕輕混合,室溫孵育5 min;將50 μL LipofectamineTM2000混合物加入質(zhì)粒DNA中,總體積為100 μL,輕輕混合,室溫孵育20 min;將100 μL DNA-LipofectamineTM2000混合物加入24孔板中,輕輕混勻,培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)液,37 ℃孵育,觀察24~48 h的轉(zhuǎn)染情況。
1.6Western blot驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24~48 h,提取重組質(zhì)粒pcDNA3.0-Flag-3C轉(zhuǎn)染組的總蛋白。培養(yǎng)細(xì)胞用冰預(yù)冷的PBS洗2次后加入RIPA裂解液,冰浴5 min,將裂解物12 000 r/min離心10 min后收集上清。在12% SDS-PAGE上分離后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂奶粉封閉2 h后,用小鼠抗Flag克隆抗體室溫孵育1 h,再經(jīng)洗膜,并與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h,最后經(jīng)發(fā)光反應(yīng),并曝光于X光片上,拍照。
1.7間接免疫熒光
細(xì)胞爬片,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞,24~48 h用4%多聚甲醛固定10 min,0.1% Trixton-100透膜處理20 min,鼠單克隆抗Flag抗體室溫孵育1 h,PBS洗滌后,TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗孵育1 h,PBS清洗后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。
2結(jié)果與分析
2.1EV71病毒3C的PCR擴(kuò)增
逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA成為cDNA,并以總cDNA為模板,PCR擴(kuò)增EV71病毒3C基因片段,所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物約為549 bp,與預(yù)計(jì)大小相同,為所需要的EV71病毒3C片段(圖2)。
2.4 Western blot檢測在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的重組融合蛋白
利用鼠抗Flag單克隆抗體檢測pcDNA3.0-Flag-3C重組載體的表達(dá),結(jié)果顯示在HeLa細(xì)胞中表達(dá)的重組載體能特異性結(jié)合Flag單克隆抗體,蛋白大小與預(yù)期相符(圖5)。
3結(jié)論與討論
小RNA病毒科病毒主要包括口蹄疫病毒、鼻病毒、腦心肌炎病毒、腸道病毒,它不僅是感染家畜的重要病原體,而且也是感染人的重要病原體。包括EV71病毒在內(nèi)的諸多小RNA病毒感染機(jī)體后,嚴(yán)重者可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥,甚至死亡[6],小RNA病毒科病毒感染會給國民生命財(cái)產(chǎn)安全和畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大的損失,這是不容忽視的。
小RNA病毒科的多種病毒都編碼3C蛋白酶,作為小RNA病毒科眾多種屬中的共同水解蛋白酶,其不僅在剪切病毒蛋白前體、促進(jìn)病毒復(fù)制中起重要作用,而且可以通過抑制抗病毒天然免疫應(yīng)答,使病毒自身在宿主細(xì)胞中大量增殖[7]。脊髓灰質(zhì)炎病毒和EV71病毒的3C蛋白可以直接裂
解RIG-I,從而抑制RIG-I下游信號[8]。甲型肝炎病毒[9]、
鼻病毒[10]和柯薩奇病毒B組3型[11]的3C蛋白可以通過直接裂解MAVS來抑制I型感染素的產(chǎn)生。FMDV病毒的3C蛋白不僅能夠切割宿主蛋白PCBP2,影響宿主蛋白的翻譯,而且能夠通過阻礙IRF-3/7的活化抑制IFN-α1/β啟動子的激活,從而抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生[12]。這些研究預(yù)示著,3C蛋白酶的研究將會在重大病毒性疾病,如手足口病、口蹄疫、病毒性心肌炎、甲型肝炎、病毒性感冒、病毒性咽峽炎等的攻克方面發(fā)揮重要的指導(dǎo)價值。
通過前期對FMDV病毒3C蛋白的研究,提示EV71病毒3C蛋白也可能具有相似的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步比較FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白生物學(xué)功能的差異,構(gòu)建了3C蛋白的真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)染HeLa真核細(xì)胞,驗(yàn)證其表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染后的結(jié)果顯示EV71病毒3C蛋白在細(xì)胞內(nèi)能夠正確表達(dá),證明構(gòu)建和轉(zhuǎn)染都是成功的。在高效表達(dá)EV71病毒3C蛋白后,采用倒置熒光顯微鏡觀察紅色熒光在HeLa細(xì)胞中的分布,結(jié)果顯示EV71病毒3C蛋白均勻定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中。該研究為后續(xù)深入研究小RNA病毒3C蛋白的生物學(xué)功能奠定了一定的基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)
[1]
楊春梅,黃麗,王海偉,等.口蹄疫病毒3C蛋白酶切割宿主蛋白PCBP2[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(6):419-422.
[2] WANG J Y,XIAO Y N,CHEKE R A.Modelling the effects of contaminated environments on HFMD infections in mainland China[J].Biosystem,2016,140:1-7.
[3] 羅永彬,井申榮.腸道病毒71型2A、3C、3D蛋白的研究進(jìn)展[J].中國生物制品學(xué)雜志,2012,25(10):1395-1398.
[4] KUO C J,SHIE J J,F(xiàn)ANG J M,et al.Design,synthesis,and evaluation of 3C protease inhibitors as antienterovirus 71 agents[J].Bioorg Med Chem,2008,16(15):7388-7398.
[5] ZHANG L J,HUANG G L,CAI Q X,et al.Optimize the interactions at S4 with efficient inhibitors targeting 3C proteinase from enterovirus 71[J].J Mol Recognit,2016,29(11):520-527.
[6] ANASTASINA M,DOMANSKA A,PALM K,et al.Human picornaviruses associated with neurological diseases and their neutralization by antibodies[J].J Gen Virol,2017,98(6):1145-1158.
[7] CHAN Y K,GACK M U.Viral evasion of intracellular DNA and RNA sensing[J].Nat Rev Microbiol,2016,14(6):360-373.
[8] BARRAL P M,SARKAR D,F(xiàn)ISHER P B,et al.RIGI is cleaved during picornavirus infection[J].Virology,2009,391(2):171-176.
[9] YANG Y,LIANG Y Q,QU L,et al.Disruption of innate immunity due to mitochondrial targeting of a picornaviral protease precursor[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(17):7253-7258.
[10] DRAHOS J,RACANIELLO V R.Cleavage of IPS1 in cells infected with human rhinovirus[J].J Virol,2009,83(22):11581-11587.
[11] MUKHERJEE A,MOROSKY S A,DELORMEAXFORD E,et al.The coxsackievirus B 3Cpro protease cleaves MAVS and TRIF to attenuate host type I interferon and apoptotic signaling[J].PLoS Pathog,2011,7(3):1-14.
[12] 王蕩.口蹄疫病毒Lpro和3Cpro調(diào)控宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)的分子機(jī)制研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011:85-90.