許勇

摘要 酶的定向進(jìn)化是用于改良酶特性的一種策略，主要包括構(gòu)建酶突變文庫(kù)和高通量篩選。目前，突變文庫(kù)的構(gòu)建手段主要有隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)和DNA改組；高通量篩選方法主要分為體內(nèi)篩選和體外篩選。該文介紹易錯(cuò)PCR、半理性設(shè)計(jì)、DNA改組、表面展示、核糖體展示和差示熒光掃描等相關(guān)技術(shù)及其應(yīng)用情況。

關(guān)鍵詞 定向進(jìn)化；易錯(cuò)PCR；DNA改組；高通量篩選

中圖分類(lèi)號(hào) Q814 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0012-03

Abstract Direct evolution of enzyme， a strategy to improve the characteristic of enzyme， mainly included constructing enzyme mutagenesis library and highthroughput screening. At present， the main methods of constructing enzyme mutagenesis library were random mutation， semirational design and DNA shuffling；highthroughput screening can be divided into in vivo screening and in vitro screening. In this study， the related techniques and their application situation， including errorprone PCR，semirational design， DNA shuffling， surface display， ribosome display and differential scanning fluorimetry， were introduced.

Key words Direct evolution；Errorprone PCR；DNA shuffling；Highthroughput screening

酶是生物體內(nèi)一種重要的催化劑，目前已發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)。由于酶在體外溫和水條件下依然具有較強(qiáng)的催化活性，其在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、化工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到廣泛使用[1]。酶在實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用，但同時(shí)具有不穩(wěn)定、底物單一、反應(yīng)條件苛刻等缺陷，而這些主要決定于其結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)等因素影響[2]。如北美螢火蟲(chóng)熒光素酶，其最適反應(yīng)溫度為23 ℃，最適反應(yīng)pH 為7.8[3]，這不利于其長(zhǎng)期保存與運(yùn)輸，大大限制了熒光素酶在微生物快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。定向進(jìn)化是達(dá)爾文選擇進(jìn)化過(guò)程在分子水平的再現(xiàn)，主要通過(guò)巧妙的技術(shù)手段建立蛋白質(zhì)的突變庫(kù)，并從中篩選出具備改良特性的蛋白質(zhì)[5]。

1 酶突變文庫(kù)的構(gòu)建手段

突變文庫(kù)的構(gòu)建手段主要有隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)和DNA改組3類(lèi)。

1.1 隨機(jī)突變

隨機(jī)突變是通過(guò)技術(shù)手段誘導(dǎo)目的基因發(fā)生堿基缺失、增添、替換等突變的方法構(gòu)建突變文庫(kù)。易錯(cuò)PCR是目前最常用的目的基因隨機(jī)突變技術(shù)。易錯(cuò)PCR是通過(guò)利用低保真度TaqDNA 聚合酶和改變PCR 反應(yīng)條件，如加入Mn、改變循環(huán)次數(shù)和dNTP濃度等，降低DNA 復(fù)制的保真度，在新DNA 鏈合成過(guò)程中增加堿基錯(cuò)配，從而使擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)較多點(diǎn)突變的一種體外誘導(dǎo)DNA 序列變異的方法[6]。劉韓等[7]利用易錯(cuò)PCR 技術(shù)向羧酸酯酶基因中隨機(jī)引入突變，建立酶基因突變文庫(kù)，篩選出的突變菌株65產(chǎn)生的酶在90 ℃的半衰期提高1.2 h。Mikhail等[8]經(jīng)過(guò)4輪易錯(cuò)PCR獲得了突變酶4TS在37 ℃時(shí)的半衰期提高了158倍，但是隨著溫度升高這種差距明顯縮小[8]。通過(guò)調(diào)整離子濃度或循環(huán)次數(shù)可以控制突變率，為防止對(duì)酶活造成破壞以及突變文庫(kù)過(guò)大難以篩選，突變率不宜太高（改變1～5個(gè)堿基或1～3個(gè)氨基酸）[5]。

理論上說(shuō)，隨機(jī)突變應(yīng)當(dāng)是目的蛋白質(zhì)的所有氨基酸位點(diǎn)都有同樣可能被替換為其他19種氨基酸。但實(shí)際上，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性、中性突變以及相鄰堿基同時(shí)突變概率較低等原因，易錯(cuò)PCR很難做到理想化的隨機(jī)突變。飽和誘變可以將蛋白質(zhì)中任意位點(diǎn)的氨基酸誘變?yōu)槠渌?9種氨基酸，構(gòu)建突變文庫(kù)。Wong等[9]于2004年首次提出序列飽和突變法（SeSaM），這是一種針對(duì)單鏈DNA進(jìn)行突變的新技術(shù)，基本原理是在PCR擴(kuò)增中，在正常dNTP中混入易被水解的α‐硫代核苷酸，得到長(zhǎng)度不同的DNA片段庫(kù)，再利用DNA末端轉(zhuǎn)移酶在片段的3-末端引入通用次黃嘌呤核苷酸，最后通過(guò)片段延長(zhǎng)、正常堿基替換構(gòu)建目的基因突變文庫(kù)。該法可以實(shí)現(xiàn)目的基因任意位點(diǎn)的隨機(jī)突變，但在試驗(yàn)過(guò)程使用了多種堿基類(lèi)似物和生物素化引物，并且操作過(guò)程繁瑣耗時(shí)（一次完整試驗(yàn)需2～3 d）[1，9]。2008年，Wong等[10]在原有序列飽和突變法基礎(chǔ)上，通過(guò)dNTP αS 、dPTP、dKTP 和 dITP等控制突變傾向，設(shè)計(jì)出了高顛換型序列飽和突變法（SeSaM-Tv+）。Acevedo等[11]利用易錯(cuò)PCR和飽和誘變聯(lián)用的方式將一種冷活性木聚酶的T5015提高了4.3 ℃。

1.2 半理性設(shè)計(jì)

隨機(jī)突變雖然效果不錯(cuò)，但依然存在突變文庫(kù)較大、有益突變率低、篩選壓力大等缺點(diǎn)。半理性設(shè)計(jì)是首先通過(guò)對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行分析確定影響特性的關(guān)鍵位點(diǎn)或區(qū)域，而后利用隨機(jī)突變或定點(diǎn)飽和突變的手段改造這一關(guān)鍵位點(diǎn)或區(qū)域，從而獲得有益突變株[12]。

Wang等[13]首先在野生型熱穩(wěn)定性醛酮還原酶Tm1743催化機(jī)制的基礎(chǔ)上，通過(guò)分子模擬手段建立其與NADPH、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的結(jié)合模型，確定影響其對(duì)映選擇性的3個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)Trp118、Trp86和Trp21，之后再對(duì)這3個(gè)位點(diǎn)分別進(jìn)行飽和誘變發(fā)現(xiàn)Trp86 和 Trp21 2個(gè)位點(diǎn)突變體的對(duì)映選擇性變化較大，并最終篩選出產(chǎn)（R）-和（S）-EHPB的最優(yōu)雙位點(diǎn)突變體W21S/W86E 和 W21L/W118H，其對(duì)映體過(guò)量值（ee value）分別為99.4% and 99.6%。

Reetz等設(shè)計(jì)的迭代飽和突變（Iterative saturation mutagenesis，ISM），依據(jù)待提高的酶學(xué)活性，選擇關(guān)鍵的突變點(diǎn)或區(qū)域，進(jìn)行反復(fù)飽和突變，最終篩選出目的突變株[1]。鈕成拓[14]根據(jù)分子動(dòng)力學(xué)模擬和定點(diǎn)突變結(jié)果，采用迭代飽和突變對(duì)芽孢桿菌屬來(lái)源 β-葡聚糖酶中 40 位、43 位、46 位和 205 位氨基酸進(jìn)行改造，通過(guò)四輪定點(diǎn)飽和突變，構(gòu)建了7個(gè)飽和突變體文庫(kù)，從中篩選得到突變體 VII（E46P/S43E/H205P/S40E），其在 70 ℃處理 1 h 后仍能保持 59.4%的剩余酶活，是野生酶經(jīng)過(guò)相同處理剩余酶活的 9.43 倍。

Reetz等[15]于2005年提出的組合活性中心飽和試驗(yàn)（combinatorial active-site saturation test，CAST）包括2個(gè)步驟：一是在酶的活性中心部位尋找一系列在空間位置上相互接近的并且在側(cè)鏈基團(tuán)取向上具有潛在的構(gòu)象協(xié)同作用的2個(gè)氨基酸對(duì)作為突變位點(diǎn)。如果選擇的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置是n，則第2個(gè)氨基酸與其空間關(guān)系上遵循以下的原則：如果第n個(gè)氨基酸在環(huán)上，則另一個(gè)氨基酸選擇第n+1位；若在β 折疊上，則選擇第n+2位，若在310螺旋上，則選擇第n+3位；若在α螺旋上，則選擇第n+4位。對(duì)選取的一對(duì)氨基酸進(jìn)行飽和隨機(jī)突變，即這一對(duì)氨基酸要突變成20種氨基酸的任何一種。以NNK（N代表任何一種核苷酸，K代表是G或T）作為突變的堿基形式，則有（4×4×2）.2 =1 024種不同的組合，而氨基酸則可突變成20.2 =400種不同的組合。該法在特定位點(diǎn)上綜合了理性設(shè)計(jì)和氨基酸組合隨機(jī)突變的特點(diǎn)，產(chǎn)生相對(duì)較小的突變文庫(kù)，減輕了篩選壓力[15]。Maddock等[16]以甘油脫水酶KpGDHt的α和β亞基融合結(jié)構(gòu)為對(duì)象，應(yīng)用CAST突變和保守引導(dǎo)突變聯(lián)用的方法，從5 500多個(gè)突變體中篩選出目標(biāo)突變體T200S。

1.3 DNA改組

DNA改組是通過(guò)同源重組或非同源重組實(shí)現(xiàn)基因片段的交換重排，構(gòu)建嵌合后代文庫(kù)。利用不同親本基因之間的重排將不同酶或突變酶的優(yōu)良特性進(jìn)行整合，獲得在某一特性上的再優(yōu)化或多種優(yōu)良特性組合的突變酶，是一種有性改組。該法可以使多基因的有益突變進(jìn)行整合構(gòu)建有益突變率較高的突變庫(kù)，減小了篩選壓力。根據(jù)序列特點(diǎn)，可以分為同源依賴(lài)型和非同源依賴(lài)型。

同源依賴(lài)型DNA改組是將具有同源區(qū)段的多個(gè)親本基因用DNase I處理成許多短小片段，再通過(guò)無(wú)引物PCR將片段延伸至完整基因長(zhǎng)度，該法利用同源區(qū)段在退火過(guò)程中的互補(bǔ)結(jié)合。來(lái)自同一基因家族的基因一般都具有同源區(qū)段，以相同基因家族的不同基因（一般要求同源度>60%）為親本基因進(jìn)行DNA改組是常用的方法[5]。Rigouin等[17]在易錯(cuò)PCR 和CAST突變技術(shù)都失敗的情況下，以相同基因家族的hASNase1基因和gpASNase1基因（同源度：75%）作為親本基因進(jìn)行DNA改組并篩選出4種Km較低的突變體，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)重組主要發(fā)生在N-末端結(jié)構(gòu)域（即催化結(jié)構(gòu)域），其中有一種突變體是在催化結(jié)構(gòu)域之前引入終止密碼子。

易錯(cuò)PCR 多用于高頻率誘變單個(gè)基因，與DNA改組技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可以集二者的優(yōu)點(diǎn)，這樣不僅可以對(duì)單一基因進(jìn)行易錯(cuò)PCR 隨機(jī)誘變，創(chuàng)造新的基因，還可以將易錯(cuò)PCR 獲得的有益基因改組，進(jìn)行序列間的重新編排，從而獲得不同種、屬基因家族里基因序列變異為更廣、功能更強(qiáng)的基因。一般做法是先用易錯(cuò)PCR 引入點(diǎn)突變，構(gòu)建起始基因文庫(kù)，篩選出所有良性克隆，再以此作為親本基因進(jìn)行DNA 改組，使得有益突變迅速積累，基因功能明顯提高。而且這樣所建的突變體庫(kù)小，定向進(jìn)化效果顯著。也可以進(jìn)行多輪改組，得到更好的結(jié)果[18]。Luo等[19]利用易錯(cuò)PCR和DNA改組聯(lián)用的方法對(duì)磷酸三酯酶進(jìn)行定向進(jìn)化，獲得的最優(yōu)突變酶活性提高了25倍，T5015達(dá)到67.6。張凱[20]通過(guò)1輪易錯(cuò)PCR和2種DNA改組方法聯(lián)用，經(jīng)過(guò)兩輪高通量篩選，最終得到酶活提高2倍的突變株。因此，易錯(cuò)PCR 與DNA改組聯(lián)合應(yīng)用逐漸成為基因誘變的主要方法之一。

2 高通量篩選方法

定向進(jìn)化手段改造編碼酶的基因必然會(huì)有數(shù)量龐大的突變庫(kù)，通過(guò)合適的篩選系統(tǒng)快速地從突變體文庫(kù)中篩選出符合目標(biāo)的蛋白質(zhì)成為關(guān)鍵[21]。目前，采用的高通量篩選方法主要可以分為體內(nèi)篩選和體外篩選2種類(lèi)型[5]。體內(nèi)篩選方法依賴(lài)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，具有代表性的是表面展示技術(shù)，而體外篩選方法則是于胞外完成（也可利用細(xì)胞組成成分），主要包括核糖體展示技術(shù)、差示熒光掃描等。

2.1 表面展示技術(shù)

表面展示技術(shù)，是運(yùn)用基因工程手段將目的基因到宿主基因組中，是目的蛋白表達(dá)并展示于宿主表面，通過(guò)親和篩選開(kāi)展綜合性功能鑒定。目前常用的表面展示技術(shù)有噬菌體表面展示技術(shù)和酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)。

2.2 核糖體展示技術(shù)

核糖體展示技術(shù)的本質(zhì)是利用形成的mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體復(fù)合物，通過(guò)核糖體把新生蛋白和其mRNA 聯(lián)系起來(lái)，通過(guò)刪除PCR 片段的終止密碼子產(chǎn)生真核PRM 復(fù)合物，產(chǎn)生的PRM 復(fù)合物隨后通過(guò)抗原包被的磁珠進(jìn)行捕獲，mRNA 通過(guò)RT-PCR 無(wú)需解離核糖體復(fù)合物就可得到相應(yīng)的DNA[22]。Skirgaila等[23]運(yùn)用體外區(qū)劃技術(shù)（in vitro compartmentalization，IVC）對(duì)核糖體展示技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，提出了區(qū)劃核糖體展示技術(shù)（compartmentalized ribosome display，CRD）。研究者們以油包水乳液的方式對(duì)單個(gè)三聚體復(fù)合物進(jìn)行區(qū)劃，實(shí)現(xiàn)單酶分子水平的篩選，最終篩選的突變型的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶在53～58 ℃依然可以催化合成完整長(zhǎng)度的cDNA片段（野生型酶在48 ℃以上即無(wú)法完成）。

2.3 差示熒光掃描（differential scanning fluorimetry，DSF）

差示熒光掃描作為一種分析蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的分析手段，其方法簡(jiǎn)單，效率高。其原理是通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行緩慢地加熱，在加熱的過(guò)程中，檢測(cè)熒光物質(zhì)與結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的蛋白相結(jié)合的量，來(lái)研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。朱磊[24]利用DSF法發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)酶切破壞糖基化修飾以后，在更低的溫度下就能使CTLA4.Ig的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。DSF可以幫助評(píng)估突變蛋白的結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性，如果活性熱穩(wěn)定性好的蛋白，結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定也好，則可以推測(cè)這種突變是通過(guò)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)來(lái)提高酶的熱穩(wěn)定性的。

3 結(jié)論與展望

定向進(jìn)化是一項(xiàng)體外改造酶的較為成熟的技術(shù)，已被成功用于改造酶的活性、熱穩(wěn)定性，底物專(zhuān)一性和對(duì)映選擇性等[5]。構(gòu)建突變文庫(kù)和高通量篩選是酶定向進(jìn)化不可或缺的組成部分。在構(gòu)建突變文庫(kù)方面還存在對(duì)突變率和突變位點(diǎn)的控制不足的問(wèn)題，堿基偏愛(ài)性的問(wèn)題依然存在，因此探索可控性更強(qiáng)的突變文庫(kù)構(gòu)建方法將是研究熱點(diǎn)。高通量篩選方面，目前并沒(méi)有一種通用的篩選方法適用于所有的改組蛋白，所以需要設(shè)計(jì)針對(duì)目的改造特征的篩選方法。要想將基因與酶的產(chǎn)物之間建立起直接的聯(lián)系依然需要針對(duì)不同酶、不同反應(yīng)和不同底物進(jìn)行設(shè)計(jì)[25]。熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）近年來(lái)發(fā)展迅速，具有快速和高通量的特點(diǎn)，是最具潛力的高通量篩選手段之一。

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