霍亂弧菌檢測(cè)方法的研究

李巧燕

摘 要：烈性腸道傳染病霍亂能引起大范圍乃至世界性大流行，在我國(guó)被列為甲類傳染病?；魜y弧菌是導(dǎo)致感染者嚴(yán)重腹瀉、引起霍亂的病原菌?；魜y弧菌的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)是霍亂預(yù)防、控制的重要依據(jù)。目前，國(guó)內(nèi)、外針對(duì)霍亂弧菌建立了許多有效的檢測(cè)方法，尤其是分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的應(yīng)用，為霍亂弧菌的檢測(cè)提供了新的手段。本文綜述了近年來(lái)霍亂弧菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌；檢測(cè)方法；分子生物學(xué)技術(shù)

一、傳統(tǒng)檢測(cè)方法

霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，常以堿性蛋白胨水作為其選擇性增菌培養(yǎng)基?；魜y弧菌生長(zhǎng)迅速，可將標(biāo)本在 37℃培 養(yǎng) 6～8h后取上層培養(yǎng)物做弧菌分離?；魜y弧菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和堿性瓊脂上呈無(wú)色、圓形、透明、光滑、濕潤(rùn)、扁平或稍凸起、邊緣整齊的菌落。

為便于檢出，根據(jù)其生長(zhǎng)特性、對(duì)某些抗生素的敏感性及與其他常見(jiàn)腸道菌的差別，國(guó)內(nèi)已研制出慶大霉素瓊脂、四號(hào)瓊脂，國(guó)外有TCBS等選擇性培養(yǎng)基。這些培養(yǎng)基一般都含有膽鹽、亞碲酸鉀、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、慶大霉素、多黏菌素等抑菌劑。

在不同的選擇性培養(yǎng)基上，霍亂弧菌具有不同的菌落特征。挑取可疑菌落后需進(jìn)行一系列生化反應(yīng)、血清凝集等試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行綜合判定，從而確定為霍亂弧菌[1]。目前，細(xì)菌培養(yǎng)、生化和血清學(xué)鑒定仍是霍亂弧菌實(shí)驗(yàn)室診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，具有較好的敏感度和特異度。但不可否認(rèn)，傳統(tǒng)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、工作量大，且易受環(huán)境、培養(yǎng)條件及主觀因素影響，不能滿足疾病預(yù)防和控制快速反應(yīng)體系的需求，不利于實(shí)驗(yàn)室的快速診斷。[2]

二、分子生物學(xué)方法

1.聚合酶鏈反應(yīng)

（1）普通聚合酶鏈反應(yīng)

運(yùn)用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechain reaction，PCR）檢測(cè)霍亂弧菌，一般選擇霍亂腸毒素（choleraenterotoxin，CT）基因 ctx的保守序列作為靶基因[3，4]。一些非產(chǎn)毒株（如環(huán)境來(lái)源的菌株）有可能通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得毒力基因成為產(chǎn)毒株，若僅檢測(cè) ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協(xié)同調(diào)節(jié)菌毛 A 基因（tcpA）、0抗原基因（rfb）、外膜蛋白基因（omp）以及毒力表達(dá)調(diào)控基因（toxR）等也被選用為 PCR的靶基因[5，6]，這大大提高了檢測(cè)的特異度。PCR方法檢測(cè)霍亂弧菌的特異度和敏感度都很高，但其本身也有缺點(diǎn)：一是因樣本DNA交叉污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性；二是由于待測(cè)樣本中的某些雜質(zhì)蛋白及核酸提取過(guò)程中用到乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、SDS等，如未去除干凈就會(huì)成為 Taq DNA 聚合酶的抑制劑，造成擴(kuò)增失敗。此外，標(biāo)本中也可能含有會(huì)降解靶核酸的核酸酶，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。因此，在運(yùn)用 PCR檢測(cè)霍亂弧菌時(shí)，要注意避免 DNA污染以及其他雜質(zhì)的干擾。

（2）多重PCR

與常規(guī)PCR相比，多重PCR一次反應(yīng)可檢測(cè)多個(gè)基因，節(jié)省了時(shí)間和成本。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、rfb、hly進(jìn)行組合[7]，作為共同的靶基因，克服了由于毒力基因特異度不夠高而造成的假陽(yáng)性。多重 PCR 同時(shí)可準(zhǔn)確區(qū)分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產(chǎn)毒株，可謂舉多得，大大提高了檢測(cè)效率。

Tarr等[8]運(yùn)用多重 PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌的 sodB、副溶血弧菌的laEf、創(chuàng)傷弧菌的 hsp等 基因，G6mez.Duarte等[9]運(yùn)用多重PCR從腹瀉患者的臨床標(biāo)本中同時(shí)檢測(cè)到包括霍亂弧菌在內(nèi)的 7種腸道致病菌。這些都大大提高 了感染性腹瀉病原學(xué)診斷的效率和水平，為多種致病菌的快速診斷提供了很好的思路和方法。多重PCR 的引物設(shè)計(jì)要注意避免各對(duì)引物之間的相互干擾和各目的片段之間的非特異性擴(kuò)增。

（3）熒光定量 PCR 熒光定量

PCR 自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、無(wú)交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應(yīng)用。尤其是近年來(lái)，隨著引物與探針的設(shè)計(jì)更精確、多通道熒光 PCR儀的開(kāi)發(fā)與廣泛使用，多重?zé)晒舛?PCR技術(shù) 日臻成熟，并以其高通量、低成本、高效率等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的快速檢測(cè)，成為應(yīng)用的熱點(diǎn)。Huang等[10] 選取 Ol和 O139群特異的 rbf基因以及 ctxA、hylA等作為靶點(diǎn)，建立了四重?zé)晒舛?PCR體系，不僅克服了單重?zé)晒舛?PCR僅檢測(cè)毒力基因特異度不高而造成假陽(yáng)性的缺點(diǎn)，而且能很好檢測(cè)并區(qū)分 01群和 O139群霍亂弧菌及其毒力株，最低檢出限達(dá)每個(gè)反應(yīng) 2個(gè)菌落形成單位（colonyformingunit，CFU）。這與單重?zé)晒舛縋CR的最低檢出限相當(dāng)，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率。Fykse等[1l]運(yùn)用基于分子信號(hào)標(biāo)記的多重?zé)晒舛?PCR體 系檢測(cè)環(huán)境標(biāo)本中霍亂弧菌的 ctxA、tcpA、toxR、hlyA、groEL等多個(gè)基因的不同組合，在一定程度上削弱了標(biāo)本中雜質(zhì)的干擾，提高了 PCR技術(shù)對(duì)環(huán)境標(biāo)本檢測(cè)的特異度，敏感度也較 TaqMan探針和 SYBR Green I方法提高了 100 倍?？梢?jiàn)，多重?zé)晒舛?PCR技術(shù)已成為未來(lái)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)，但必須保證不同探針?biāo)鶚?biāo)記的光基團(tuán)問(wèn)無(wú)相互干擾，且各目的片段有相近的擴(kuò)增效率。

2、基因芯片

與 PCR方法相 比，基因芯片技術(shù)能同時(shí)獲得更多病原學(xué)、生物學(xué)方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]運(yùn)用基因芯片技術(shù)對(duì)多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐藥基因及潛在的毒力基因進(jìn)行全面分析，對(duì)掌握這些細(xì)菌的致病性及進(jìn)行有效預(yù)防、控制等具有重要意義。但基因芯片成本較高，距離推廣應(yīng)用尚需時(shí)間等待。

3、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（1oop.mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是 2000年 Notomi等發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法。此方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì) 4條特異性引物，利用鏈置換 DNA 聚合酶（BstDNA polymerase）在恒溫條件（60-65℃）孵育 40-60min，引發(fā)自動(dòng)鏈循環(huán)取代反應(yīng)，完成對(duì)靶基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)電泳或直接通過(guò)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行檢測(cè)。Yamazaki等[13]。采用 LAMP檢測(cè)霍亂弧菌的 ctxA基因，最低檢測(cè)限達(dá)每個(gè)反應(yīng) 1.4 CFU，比普通PCR高近 10倍，說(shuō)明該方法具有很高的靈敏度。

參考文獻(xiàn)

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