薄層色譜法檢測玉米中黃曲霉毒素Bl

馮莉

摘要：黃曲霉毒素（簡稱AFT）是由黃曲霉和寄生曲霉所產(chǎn)生的次生代謝物，具有很強(qiáng)的毒性和致癌性，在自然條件下，黃曲霉毒素耐熱性強(qiáng)，當(dāng)溫度達(dá)到280℃時才發(fā)生裂解而破壞，因此常規(guī)烹調(diào)條件下很難將其清除。本文討論應(yīng)用薄層色譜法對毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素Bl進(jìn)行的檢測，文中討論了薄層板的制法、點(diǎn)樣、展開的方法以及不同現(xiàn)象所對應(yīng)的黃曲霉毒素Bl的污染情況。

關(guān)鍵詞：玉米；真菌毒素；黃曲霉毒素Bl；薄層色譜

中圖分類號：S513

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）08-0020-01

黃曲霉毒素不是單一的一種毒素，是一類結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，包括十七種異構(gòu)體。在紫外線的照射下可發(fā)出熒光，根據(jù)熒光顏色的不同，可以把黃曲霉毒素分為B族和G族。黃曲霉毒素對玉米及其制品的污染非常廣泛，對人體的危害分級屬于極毒類，對人主要引起急性中毒性肝炎和中毒性腦病。黃曲霉毒素的慢性中毒發(fā)生在高溫高濕地區(qū)黃曲霉毒素污染嚴(yán)重的地區(qū)，表現(xiàn)類似雷耶氏癥。動物試驗(yàn)表明黃曲霉毒素具有強(qiáng)致癌性。其被定為I類可能致癌物，其中黃曲霉毒素Bl的毒性更是居于首位。

1 實(shí)驗(yàn)原理

一定量玉米樣品粉碎至一定細(xì)度，用適當(dāng)?shù)娜軇⑵渲械狞S曲霉毒素Bl經(jīng)過一系列的提取以及濃縮操作之后在薄層板上進(jìn)行薄層分離，然后在波長為365 nm的紫外光照射下能夠發(fā)出藍(lán)紫色的熒光，與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)比對，根據(jù)其產(chǎn)生熒光反應(yīng)的最低檢出量來對樣品中的黃曲霉毒素Bl進(jìn)行定量，其最低檢出限量為0.0004 μg。

2 儀器和試劑

儀器：錘式旋風(fēng)磨；樣品篩；調(diào)速振蕩器；電子天平（0.1 g）；玻璃板；薄層板涂布器；展開槽；紫外光燈；微量注射器。試劑：三氯甲烷；石油醚；甲醇；苯；乙腈；無水乙醚；丙酮；硅膠G；三氟乙酸；無水硫酸鈉；氯化鈉；黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)品；次氯酸鈉溶液（25 g/L）。以上試劑未注明純度的均為分析純。

3 薄層實(shí)驗(yàn)

3.1 樣品處理

由于玉米籽粒較大，污染嚴(yán)重的樣品一粒就會左右檢測結(jié)果，因此需要大量取樣，將分取的1 kg左右玉米樣品全部粉碎之后混勻，稱取充分混勻的樣品20 g于具塞磨口三角瓶中，再加入石油醚 甲醇混合液（30 mL石油醚+100 mL55%甲醇水溶液），之后置于調(diào)速振蕩器上振蕩30 min，將靜置后的溶液濾入分液漏斗，靜置直至分層，從下方將甲醇溶液放入另一具塞磨口錐形三角瓶中，移取20 mL濾液至另一分液漏斗加20 mL三氯甲烷，振搖后靜置分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)無水硫酸鈉后用慢速濾紙濾入50 mL蒸發(fā)皿中，再用少量三氯甲烷重復(fù)振搖提取并清洗過濾設(shè)備，并入蒸發(fā)皿中，將其置于通風(fēng)櫥，在65℃的水浴條件下?lián)]發(fā)后取下，冷卻并加入1 mL苯乙腈混合液（98 mL苯+2 mL乙腈），混合均勻充分溶解后，用膠頭滴管吸取清液于2 mL具塞試管中備用。

3.2 薄層板制備

用天平稱取硅膠G約3g，加入8g水，研磨成糊狀后轉(zhuǎn)移至薄層板涂布器中，涂成厚度約為0. 25 mm，長20 cm寬為5 cm的薄層板共三塊。置于空氣中干燥15 min，置于烘箱中，在100℃條件下活化2h左右，置于干燥器中備用。3.3點(diǎn)樣、展開與觀察

點(diǎn)樣：以薄層板一端距邊緣3 cm處作為基線，樣液要點(diǎn)在基線上，每塊薄層板寬5 cm，點(diǎn)樣時每點(diǎn)之間及邊緣的距離均為l cm，可點(diǎn)四個樣點(diǎn)，用微量注射器滴加樣液，控制每點(diǎn)的大小均勻一致，其直徑約為3 mm。從左到右依次為①10 μL黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/ mL）；②20 μL制備好的樣液；③20 μL樣液與10 μL黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04 μg/mL）；④20 μL樣液與10 μL黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.2 μg/mL）。

展開與觀察：加入10 mL無水乙醚于展開槽內(nèi)進(jìn)行預(yù)展開12 cm吹干之后加10 mL丙酮三氯甲烷混合溶液（8mL丙酮+92 mL三氯甲烷）于另一展開槽展開12 cm。第四點(diǎn)的高濃度黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)使用液熒光點(diǎn)起到定位作用；如第二點(diǎn)未出現(xiàn)熒光反應(yīng)，表明樣品中黃曲霉毒素Bl含量在5μg/kg以下，此時第三點(diǎn)用做檢查最低檢出量是否正常產(chǎn)生熒光反應(yīng)，如第二點(diǎn)出現(xiàn)陽性反應(yīng)，第三點(diǎn)則起到定性作用，同時需要對樣品做確證實(shí)驗(yàn)。加滴3滴三氟乙酸生成衍生物，與黃曲霉毒素Bl標(biāo)準(zhǔn)使用液產(chǎn)生的衍生物對比，判斷其熒光反應(yīng)是否是由于樣品中存在黃曲霉毒素Bl而產(chǎn)生的。如果樣液熒光點(diǎn)的強(qiáng)度與第一點(diǎn)一致，則確證實(shí)驗(yàn)之后即可認(rèn)為樣品中黃曲霉毒素Bl含量為5μg/kg，如果樣液熒光點(diǎn)的強(qiáng)度大于第一點(diǎn)，則根據(jù)其強(qiáng)度稀釋樣液做展開實(shí)驗(yàn)，直至樣液熒光點(diǎn)的強(qiáng)度與第一點(diǎn)一致，按照稀釋比例計算樣液黃曲霉毒素Bl含量。

4 結(jié)論

薄層色譜法測定玉米樣品中黃曲霉毒素Bl方法簡便易操作，對實(shí)驗(yàn)條件和儀器的要求不高，然而該方法只能做定性實(shí)驗(yàn)以及粗略的定量，如需準(zhǔn)確定量則不能采用此種方法。