鮑岳 張俊華 蘇振華 曹雪松

摘 要：本研究建立了一種方便快捷地檢測DNA雙鏈斷裂引起的基因重組的方法。傳統(tǒng)的檢測DNA雙鏈斷裂的方法較為復(fù)雜、繁瑣。因此，構(gòu)建簡單、快速的此類檢測技術(shù)是非常必要的。本研究構(gòu)建了利用正向重復(fù)片段的GUS基因載體以及引導(dǎo)RNA和噬菌體MS2外殼蛋白偶聯(lián)限制性核酸內(nèi)切酶的基因組編輯系統(tǒng)，在GUS基因內(nèi)部DNA重復(fù)區(qū)切割DNA，導(dǎo)致雙鏈斷裂（doublestrand breaks， DSBs），DSB經(jīng)同源序列引導(dǎo)修復(fù)（homologydirected repair， HDR）途徑，引起GUS基因重組，恢復(fù)其功能。此方法可以經(jīng)過GUS染色后快速、直觀地檢測位點(diǎn)特異的DSB。通過GUS與其底物的反應(yīng)，以達(dá)到半定量、直觀快速檢測DSB的目的。

關(guān)鍵詞：GUS基因；DNA雙鏈斷裂；GUS染色；基因重組

中圖分類號：Q784 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

AnEfficient Detecting System for Genes Recombination Caused by DNA Double

Strand Breaks Using Direct Reapeated Report Gene of GUS

Bao Yue Zhang Junhua Su Zhenhua Cao Xuesong*

College of Life Sciences Liaocheng University Shandong Liaocheng 252000

Abstract： In this study， a convenient and quick method for detecting gene recombination caused by DNA double strand breaks （doublestrand breaks，DSBs） was established. DNA DSBs can cause sitespecific homologydirected repair（HDR）. However， the traditional methods of detecting DNA DSBs are complicated and cumbersome. Consequently， it is necessary to develope such a simple and fast detection technique. This study was conducted by using the direct repeated GUS gene and guide RNA combined with phage MS2 coat protein coupled with restriction endonuclease genome editing system， in which gRNA is complementary with GUS repeat sequences. Based on producing DSBs， functional GUS gene can be restored via HDR. By using the staining reaction of GUS with its substrate， the results can be achieved and quantitative detection of DSBs can be established. This method can be used quickly to detect site specific DSBs and intuitively observe the results after GUS staining.

Key words： GUS gene； DNA double strand breaks； GUS staining； gene recombination

1 緒論

隨著生命科學(xué)的研究和發(fā)展，數(shù)量繁多的基因或其調(diào)控因子的功能需要鑒定，作為研究基因功能最為有效的方法，定點(diǎn)基因突變研究越來越受到人們的關(guān)注，基因組編輯（genome editing， GE）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。因此，建立一種高效而又精確的檢測基因定點(diǎn)突變技術(shù)是十分必要的。而檢測GE的前提是能夠檢測DSB，但是傳統(tǒng)的檢測DNA雙鏈斷裂的方法較為復(fù)雜、繁瑣。因此，構(gòu)建簡單、快速的此類檢測技術(shù)是非常必要的。近年來，伴隨著不同的核酸酶以及DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的闡明，基因組編輯技術(shù)已推廣及其應(yīng)用到許多生物中。將DNA結(jié)合蛋白的識別結(jié)構(gòu)域和核酸酶的切割結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對任意的特定DNA序列進(jìn)行定點(diǎn)識別與切割。造成的DNA產(chǎn)生DSBs，后者通過兩種DNA修復(fù)方式，一種是HDR，另一種是非同源末端連接（nonhomologous end joining， NHEJ）。HDR在有外源的同源DNA存在的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)對特定堿基的替換，即對點(diǎn)突變進(jìn)行恢復(fù)。NHEJ則是在被切割處的DNA序列發(fā)生缺失或插入等的突變。目前被廣泛應(yīng)用的GE技術(shù)主要有人工介導(dǎo)的鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nuclease， ZFN）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activatorlike effector nucleases， TALEN）和由RNA介導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）技術(shù)，DSB經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制（HDR或NHEJ）的修復(fù)從而實(shí)現(xiàn)基因的插入、缺失和堿基替換等基因突變，以達(dá)到引起不同細(xì)胞系或生物體中的基因組發(fā)生改變的目的。再者，GE是能夠破譯基因功能和可以應(yīng)用到基因治療的一種有力工具。而在CRISPR /Cas系統(tǒng)中，Cas9核酸內(nèi)切酶識別所必需的原間隔序列的3端含有的一個原間隔臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM），PAM區(qū)是CRISPR/Cas系統(tǒng)中Cas蛋白識別CRISPR的序列標(biāo)記[1，2]，對雙鏈進(jìn)行切割。此外，最近的研究表明，該系統(tǒng)與ZFN和TALEN一樣，可在非目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行打靶，從而造成脫靶現(xiàn)象[3，4]。因此，對DNA雙鏈斷裂進(jìn)行檢測是研究GE產(chǎn)生及其效率的關(guān)鍵。DNA雙鏈斷裂的檢測技術(shù)主要有以下幾類。

1.1 γH2AX檢測方法

DNA損傷及雙鏈斷裂的檢測方法有很多，目前最為常用的是γH2AX檢測方法。組蛋白2A變異體（histone family 2A variant， H2AX）屬于核心組蛋白H2A家族中的一個亞型。DNA損傷及雙鏈斷裂后，產(chǎn)生磷酸化底物。這些DSBs都具有快速誘導(dǎo)H2AX的大量磷酸化（γH2AX）和簇集的功能[5]。所以，γH2AX可以作為DNA的損傷標(biāo)記[6]，通過檢測γH2AX，進(jìn)而可以檢測DNA雙鏈斷裂，該方法在藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均有應(yīng)用。

迄今為止，已經(jīng)開發(fā)了很多種技術(shù)和方法來檢測γH2AX， Rogakou等在正常的細(xì)胞受到外源性的物理輻射后觀察到H2AX發(fā)生磷酸化，并導(dǎo)致γH2AX斑點(diǎn)出現(xiàn)[7]；在γH2AX斑點(diǎn)形成后，觀察斑點(diǎn)的數(shù)目與DSB的數(shù)量呈正相關(guān)[8，9]。據(jù)此有研究表明，由γH2AX焦點(diǎn)的數(shù)量推算出的輻射劑量與DNA的DSB的數(shù)量曲線中可以計(jì)算出，每一個已經(jīng)完成培養(yǎng)的正常的細(xì)胞可以在每單位輻射劑量（Gy）的電離輻射下造成有3539個DNA的DSB損傷的出現(xiàn)[10]。而檢測的方法主要包括（1）免疫熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡分析方法：這個方法被應(yīng)用于早期DNA損傷研究，主要利用熒光顯微鏡技術(shù)和顯微鏡成像技術(shù)[11]。如果是用人工進(jìn)行分析，通過熒光顯微鏡檢查是否有熒光標(biāo)記的γH2AX 灶點(diǎn)。缺點(diǎn)在于人工進(jìn)行操作，人為的觀察可能會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響和偏差較大[12，13]。如果是自動化分析，基于手動操作或者是全自動顯微鏡，對熒光染色并制成玻片標(biāo)本的細(xì)胞拍照后，利用圖像分析軟件分析每個細(xì)胞核中的γH2AX 灶點(diǎn)的數(shù)目和分布以及它們的熒光強(qiáng)弱。利用自動化進(jìn)行分析，相比較于人工分析，優(yōu)點(diǎn)在于準(zhǔn)確性高、結(jié)果更加可靠，而且相較于人工操作，自動化分析的速度更快，能夠得出把所得的定量的結(jié)果直接進(jìn)行圖片保存，方便以后的分析[14]；（2）流式細(xì)胞術(shù)（ flow cytometry，F(xiàn)CM） 分析方法：使用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)過免疫熒光標(biāo)記的細(xì)胞，能夠分析每個細(xì)胞核中的熒光強(qiáng)度，甚至能夠測定含有熒光的細(xì)胞所占的百分比是多少[15]。這種方法的優(yōu)點(diǎn)就在于速度快，準(zhǔn)確性高。但缺點(diǎn)也是非常顯著的，由于被分析的細(xì)胞被破壞，無法分析每個細(xì)胞核中γH2AX 灶點(diǎn)個數(shù)和分布[16]；（3）全細(xì)胞酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ Wholecell ELISA assay） 檢測方法：這種檢測方法所依據(jù)的原理是利用使用過氧化物酶結(jié)合的第二抗體去替代免疫細(xì)胞化學(xué)方法中的熒光分子結(jié)合的第二抗體，然后過氧化物酶與底物進(jìn)行反應(yīng)，能夠產(chǎn)生一定量的顯色產(chǎn)物，從而得到細(xì)胞內(nèi)γH2AX的含量。這種操作方法的優(yōu)點(diǎn)就在于操作簡單、速度快。但缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確分析每個細(xì)胞核內(nèi)的γH2AX 灶點(diǎn)數(shù)量和分布數(shù)據(jù)[17]。

總之，利用γH2AX對DNA雙鏈的斷裂進(jìn)行檢測，方法較為復(fù)雜，操作比較繁瑣。再者，有部分細(xì)胞活動并不導(dǎo)致DSBs的產(chǎn)生，但是仍然有可能產(chǎn)生γH2AX，因此有必要針對具體應(yīng)用進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，并分析γH2AX產(chǎn)生的機(jī)制；第三，雖然檢測到的γH2AX 含量和DSBs呈正相關(guān)關(guān)系，但不能精確計(jì)算出后者產(chǎn)生的數(shù)量。

1.2 熒光報(bào)告基因檢測

還有一種方法是利用熒光報(bào)告基因來檢測DSB。這種方法是通過構(gòu)建突變的熒光蛋白載體來實(shí)現(xiàn)的。該技術(shù)又分為二類，一是構(gòu)建在熒光蛋白基因內(nèi)部插入含有終止密碼DNA片段載體，當(dāng)經(jīng)過GE導(dǎo)致插入DNA片段產(chǎn)生突變后，一部分熒光蛋白基因的讀碼框恢復(fù)功能，因而可通過檢測熒光來檢測DSB[18]。但該方法只能檢測到使熒光蛋白基因恢復(fù)讀碼框的突變，而其余的則不能檢測到；第二類是構(gòu)建含有重復(fù)DNA片段的熒光蛋白或其他報(bào)告基因的載體，當(dāng)經(jīng)過GE導(dǎo)致重復(fù)DNA片段產(chǎn)生突變后，經(jīng)過HDR修復(fù)使熒光蛋白基因的讀碼框恢復(fù)功能，因而可通過檢測熒光來檢測DSB[19]。但目前該方法在植物突變研究中，主要在轉(zhuǎn)基因植物中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)耗時長。

1.3 GRATEN系統(tǒng)

我們構(gòu)建了引導(dǎo)RNA偶聯(lián)核酸內(nèi)切酶（guided RNA and tethered endonuclease， GRATEN）引起DSB的技術(shù)，基于序列重疊的β葡糖醛酸糖苷酶（GUS）基因[20]，通過HDR修復(fù)產(chǎn)生的基因突變進(jìn)行恢復(fù)。GRATEN系統(tǒng)包含二個組分，一是串聯(lián)的引導(dǎo)RNA （guided RNA， gRNA）和可與噬菌體MS2外殼蛋白（MS2 coat protein， MCP）結(jié)合的RNA；另一部分是融合的MCP和核酸內(nèi)切酶FokI切割結(jié)構(gòu)域基因。該系統(tǒng)的工作原理是，當(dāng)gRNA與基因組的同源DNA配對形成R環(huán)（Rloop）結(jié)構(gòu)后，與MCP結(jié)合的RNA通過將FokI引導(dǎo)至Rloop鄰接區(qū)域，二聚體化的FokI切割DNA形成DSB，導(dǎo)致GE的產(chǎn)生（圖A）。為了驗(yàn)證GRATEN系統(tǒng)產(chǎn)生DSB的可能性，我們在植物表達(dá)載體中構(gòu)建了含有部分重復(fù)序列的GUS基因（35SGUUS）。通過在煙草（Nicotiana benthamiana）葉片中瞬時共表達(dá)GRATEN和35SGUUS，GUS基因得到恢復(fù)。證明GRATEN導(dǎo)致序列特異性DSB以及利用35SGUUS檢測DSB是切實(shí)可行的。

Figure A： GRATEN system[HT]

GRATEN系統(tǒng)載體的構(gòu)建：在TNPs模塊中，淺藍(lán)色部分為花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子；核定位信號（NLS）（紫色部分）；核酸內(nèi)切酶FokI（粉色部分）；噬菌體外殼蛋白MCP（黃色部分）；胭脂氨酸合成酶的轉(zhuǎn)錄終止子Tons（灰色部分）；在gRNA模塊中，5'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以藍(lán)色矩形表示、MCP binding以棕色矩形表示、gRNA以紅色矩形表示；擬南芥Pol III啟動子（AtU6）；5'端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hp）；三個結(jié)合MS2的位點(diǎn)（3XMS2 binding）；對應(yīng)基因組靶位點(diǎn)的gRNA（Target）；終止AtU6啟動的翻譯終止子，8個胸腺嘧啶（8T）。

Schematic of GRATEN system. In the TNPs， 35S promoter from cauliflower mosaic virus （CaMV） in white； nuclear localization signal （NLS） in purple； endonuclease FokI in pink； MS2 bacteriophage coat protein （MCP） in yellow； transcriptional terminator of nopaline synthase gene（Tnos） in gray； In the gRNA， the 5 end hairpin， gRNA and MCP binding sites are denoted in blue， red and brown lines respectively. AtU6， promoter of polymerase III from Arabidopsis thaliana； Hp， 5 end hairpin structure； 3×MS2 binding， triple MS2 binding sites； Target， target sequence in genomic locus. 8T， octuple thymines for terminating transcription driven by U6 promoter.

2 材料和方法

2.1 GRATEN系統(tǒng)的構(gòu)建

我們所構(gòu)建的GRATEN系統(tǒng)，是由以下原件組成：① Pol III啟動子。將編碼gRNA的DNA克隆到該啟動子下游，其中g(shù)RNA是針對目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)的；②FokIMS2FokI融合基因克隆。將FokIMS2FokI三個基因片段串聯(lián)，二端加上核定位信號（Nuclear Localization Signal， NLS），并在C端加6×His標(biāo)簽。將以上串聯(lián)的基因克隆到植物表達(dá)載體35S啟動子下。上述克隆經(jīng)DNA測序驗(yàn)證。如圖A所示，MS2蛋白可以形成同源二聚體結(jié)構(gòu)，這個同源二聚體結(jié)構(gòu)首尾反向平行，在MCP的兩端連接FokI限制性核酸內(nèi)切酶，形成一個結(jié)構(gòu)形式為FokIMS2FokI的融合蛋白，命名為偶聯(lián)核酸融合蛋白（tethernuclease fusion proteins，TNPs），所形成的這個二聚體會在靶DNA的RLoop結(jié)構(gòu)上游對DNA進(jìn)行切割，造成DSBs。而在我們的實(shí)驗(yàn)中，就是對GUUS的重復(fù)片段進(jìn)行切割，切割完成后，通過HDR途徑恢復(fù)成有功能的GUS基因，然后，利用GUS基因的特性進(jìn)行檢測。

我們的模板選擇載體質(zhì)粒pBluescript II KSGUS1進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，NGUS5和NGUR作為擴(kuò)增引物，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，能夠檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物為1035bp的GUS1片段（圖B）；我們的另外一個擴(kuò)增是以NUSF和NGUS3為引物，以載體質(zhì)粒pBSGUUS為模板，檢測到擴(kuò)增產(chǎn)物為1413bp的GUS2片段（圖C）；若載體變?yōu)镹co I和Bste II雙酶切載體質(zhì)粒pBSGUUS，則是2423bp的GUUS片段（圖D）；以載體質(zhì)粒p1305GUUS為模板，以NGUS5和NGUS3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，即得到2423bp的GUUS片段（圖E）。

2.2 植物材料及轉(zhuǎn)基因操作

實(shí)驗(yàn)材料選擇生長狀況良好的本氏（Nicotiana Benthamiana， N. Benthamiana）煙草植株。

將構(gòu)建的重組載體質(zhì)粒與對照共同轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，將含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)直至對數(shù)生長期，離心收集菌體，然后加入滲透注射緩沖液，重懸至OD600 值約為 0.5～1.0，遮光條件下室溫靜置 2～3 hrs后用于滲透注射。滲透注射苗齡為4周左右的煙草葉片，采用農(nóng)桿菌滲入法侵染煙草葉片，用針頭在植株葉片上扎兩個孔，用無針頭的注射器對葉片進(jìn)行注射，依靠壓力將菌液注入葉片的葉脈之間，實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物瞬時表達(dá)。滲透注射后的煙草植株在弱光條件下培養(yǎng)一天，然后放于可見光下正常培養(yǎng)，瞬時表達(dá)48h后取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 GUS染色及觀察

GUSRec系統(tǒng)的工作原理（詳見圖F），我們通過將構(gòu)建的載體質(zhì)粒與p1305GUUS載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，共同滲透注射4周左右苗齡的煙草葉片，進(jìn)行農(nóng)桿菌植物瞬時表達(dá)，培養(yǎng)三天后剪下葉片進(jìn)行GUS染色和觀察。

（1）GUUS表達(dá)載體。35S及NOST分別為啟動蛋白表達(dá)的啟動子和終止子，兩個灰色方框（U）表示GUS基因內(nèi)部重復(fù)片段，gRNA的識別和切割序列用箭頭來表示；（2） GUSRec與我們所設(shè)計(jì)的載體共同表達(dá)，經(jīng)gRNA引導(dǎo)并經(jīng)TNP切割產(chǎn)生DSB，GUS基因內(nèi)部重復(fù)片段間經(jīng)同源鏈交換重組；（3）GUS基因恢復(fù)正常閱讀框。

（1）GUUS expression vector. 35S and NOST are promoter and terminator for gene transcription respectively， two gray boxes （U） represent the direct repeats of intenal GUS gene， gRNA recognition and cleavage sequence represented by arrows. （2）GUSRec and the vector are expressed in one cell simultaneously， after gRNA guiding and cleavaged by TNP ， producing DSB， GUS gene can be restored between direct repeat sequences by singlestrand invasion， strand exchange and homologous recombination.（ 3）GUS gene recover to normal reading frame.

3 結(jié)果

觀察瞬時表達(dá)GUS，得到了以下的結(jié)果：空載體瞬時表達(dá)后，經(jīng)GUS染色后沒有顏色（如圖G1）；以gRNA作對照，經(jīng)GUS染色后沒有顏色（如圖G2）；GUS表達(dá)體瞬時表達(dá)后，經(jīng)GUS染色呈現(xiàn)出藍(lán)色（如圖G4）；只轉(zhuǎn)化p1305GUUS載體質(zhì)粒的葉片，經(jīng)GUS染色后不會出現(xiàn)藍(lán)色（如圖G3）；共同轉(zhuǎn)化p1305gRNAFMF載體與p1305GUUS載體，能夠瞬時表達(dá)GUS，經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)出部分藍(lán)色（如圖G5），為了避免因葉片狀態(tài)對瞬時表達(dá)造成的影響，觀察同一葉片瞬時表達(dá)，如圖G6。說明GUUS基因經(jīng)切割重組后恢復(fù)為正常讀碼框的GUS基因，并翻譯成GUS蛋白。并且這種發(fā)生在GUS基因內(nèi)部重復(fù)區(qū)的位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂是由gRNA引導(dǎo)的，而且是由二聚體FokI切割產(chǎn)生的。因此我們證明我們設(shè)計(jì)的GRATEN系統(tǒng)能夠在特定位點(diǎn)進(jìn)行切割，并且由切割產(chǎn)生的DSB及其經(jīng)HDR修復(fù)的效率較高（約為35%），該技術(shù)系統(tǒng)可用于快速檢測基因組編輯產(chǎn)生的特異位點(diǎn)DNA切割及其HDR修復(fù)。

4 結(jié)論

利用報(bào)告基因檢測位點(diǎn)特異性DSB不僅可用于驗(yàn)證GE致突變的特異性和效率，而且可研究各種生物和非生物致突變劑對DNA的損傷程度，同時也可研究動植物在生理?xiàng)l件下產(chǎn)生DSB及其損傷修復(fù)機(jī)制。已有的檢測DNA的DSB技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：（1）操作步驟繁瑣。如γH2AX檢測方法；（2）結(jié)果不穩(wěn)定。如利用熒光報(bào)告基因進(jìn)行的檢測，一是需要熒光顯微鏡。二是在進(jìn)行檢測時，在紫外光下熒光會迅速產(chǎn)生淬滅，對精確統(tǒng)計(jì)結(jié)果有影響；三是植物細(xì)胞會產(chǎn)生自發(fā)熒光，對結(jié)果存在干擾；（3）植物中尚缺乏快速、穩(wěn)定檢測方法。植物中利用GUUS系統(tǒng)只運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因植物的DSB及其DNA重組研究，尚未發(fā)現(xiàn)利用其檢測基因瞬時表達(dá)的研究。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有以下的優(yōu)點(diǎn)：（1） 實(shí)驗(yàn)步驟簡單，得到結(jié)果較快。整個實(shí)驗(yàn)過程只需23天即可得到結(jié)果。相較于轉(zhuǎn)基因植物具有較高的效率，并且可作為后者的先期驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)；（2）GUS染色穩(wěn)定，結(jié)果重復(fù)率高；（3） GUS染色是經(jīng) β葡萄糖醛酸酶（betaglucuronidase）催化底物5溴4氯3吲哚β葡萄糖苷酸（XGluc）而產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)物，由于酶促反應(yīng)具有較高的效率，因此我們推測利用GUS基因恢復(fù)技術(shù)可檢測發(fā)生頻率較低的基因組DSB；（4）首次發(fā)現(xiàn)GRATEN系統(tǒng)可產(chǎn)生位點(diǎn)特異性的DSB，并且其切割DNA效率較高。該系統(tǒng)具有以下特點(diǎn)：（1）設(shè)計(jì)、構(gòu)建打靶載體簡單。因?yàn)榕cMCP結(jié)合RNA以及MCP：FokI融合蛋白只需構(gòu)建一次，只需將針對特定基因組序列的gRNA構(gòu)建到載體中U6啟動子的下游。（2）系統(tǒng)作用效率高。由于gRNA與MCP：FokI融合蛋白在同一載體上，可實(shí)現(xiàn)在同一細(xì)胞中同時高效表達(dá)以上二個組分及其產(chǎn)生作用的目的，避免了因RNA和蛋白分別在二個載體表達(dá)，從而需要共同侵染植物而產(chǎn)生的共表達(dá)效率低的弊端。

作者貢獻(xiàn)：

曹雪松老師負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，鮑岳主要負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的完成和數(shù)據(jù)的分析以及論文的撰寫，張俊華和蘇振華負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)的協(xié)助進(jìn)行，全體作者閱讀并同意全文。

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基金項(xiàng)目： 項(xiàng)目來源“基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的新型植物基因組編輯技術(shù)研究”（No：31370387）

作者簡介：第一作者鮑岳（1993），女，山東聊城人，碩士，研究方向：基因組編輯。

*通訊作者：曹雪松（1962），男，安徽人，博士研究生，教授，研究方向：基因組編輯。