夏 天 (浙江省余姚市第四中學(xué) 浙江余姚 315400)
“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測”是浙科版高中生物學(xué)選修1 第2 部分 “酶的應(yīng)用”中的實驗[1]。按照教材的步驟進行實驗,淀粉溶液經(jīng)固定化酶柱后的流出液遇KI-I2溶液不變色或呈淺黃色。 這可能由于過柱的流速過慢,淀粉水解反應(yīng)過于充分所致。 因為α-淀粉酶作用于淀粉內(nèi)的α-1,4-糖苷鍵,水解淀粉產(chǎn)生糊精、低聚糖、麥芽糖和葡萄糖等[2]。因此,在教學(xué)前,教師應(yīng)根據(jù)α-淀粉酶的活性進行預(yù)實驗,摸索適宜的實驗條件。
用5 mL 塑料注射器的外套、輸液器的管路和流量調(diào)節(jié)器組建實驗裝置,并固定于鐵架臺上[3](圖1)。 使用輸液器的流量調(diào)節(jié)器代替夾子,便于控制過柱的流速。
0.05 %可溶性淀粉溶液配制:取50 mg 可溶性淀粉溶于100 mL熱水中,攪拌均勻,加熱至透明、 無沉淀,即制成淀粉膠體,冷卻后備用。溶液的配制可按比例放大。
2.1 α-淀粉酶的固定化 實驗溫度為30℃。 在燒杯中將5 mg α-淀粉酶溶于4 mL 蒸餾水中。 再加入5 g 石英砂,緩慢攪拌10 min[3],使α-淀粉酶吸附到石英砂上。將剪成合適大小的圓形濾紙片放入注射器外套底部,作為篩板(防止石英砂漏出)。 將吸附α-淀粉酶的石英砂裝入注射器外套(圖1),體積約為4 mL。用5 倍柱體積(20 mL)的蒸餾水洗滌固定化酶柱,除去未吸附的α-淀粉酶,調(diào)節(jié)流量調(diào)節(jié)器,流速為1 mL/min,約20 滴/min。
蒸餾水洗滌酶柱約5 mL 后,取1 支試管,加入5 滴流出液,再加入1 mL 可溶性淀粉溶液,混勻,反應(yīng)3 min,加入2 滴KI-I2溶液,溶液不變色,說明流出液中含有α-淀粉酶(圖2B,本文圖2、圖3 見封四);蒸餾水洗滌酶柱約20 mL 后,再取1 支試管,加入5 滴流出液,再加入1 mL 可溶性淀粉溶液,混勻,反應(yīng)3 min,加入2 滴KI-I2溶液,溶液呈藍(lán)色,說明流出液中已不含α-淀粉酶(圖2C),可以進行后續(xù)實驗。以1 mL 可溶性淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作為對照(圖2A)。
2.2 固定化α-淀粉酶水解淀粉 實驗溫度為30℃。 將流量調(diào)節(jié)器流速調(diào)節(jié)為12 滴/min,用滴管滴加0.05%可溶性淀粉溶液。在流出5 mL 溶液后,取1 支試管接收1 mL 流出液,加入2 滴KI-I2溶液,混勻,溶液呈紅色(紫紅色)(圖3A),表明淀粉被水解為糊精。用蒸餾水稀釋1 倍后觀察,則紅色變淺(圖3B)。 以淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作為對照(圖3)。
2.3 酶柱的保存和重復(fù)使用 實驗后,用40 mL蒸餾水洗滌酶柱,取1 支試管接收1 mL 流出液,加入2 滴KI-I2溶液,溶液無顏色變化,表明酶柱沒有殘留淀粉或糊精。放置于4℃冰箱中保存。3 d 后再重復(fù)實驗,實驗結(jié)果與第1 次相同,表明固定化酶具有可重復(fù)使用的優(yōu)點。
本實驗通過對實驗條件和步驟的優(yōu)化,使實驗現(xiàn)象明顯,實驗時間縮短,且讓實驗更易操作。主要體現(xiàn)在以下3 個方面: ①量化試劑用量。 例如,洗滌酶柱的蒸餾水用量換算為具體體積;液體的過柱流速以滴/min 為單位,方便計量。 ②用于洗去未吸附的α-淀粉酶的蒸餾水用量為20 mL(教材中為40 mL),節(jié)約了實驗時間。 ③淀粉溶液的過柱流速由“6 滴/min(0.3 mL/min)”調(diào)整為“12 滴/min”。徐平珍[4]實驗表明,流速控制在10~20 滴/min,則流出液遇KI-I2溶液呈紅色。 但預(yù)實驗是必不可少的,由于酶活性的不同,得到明顯實驗現(xiàn)象的流速會不同。 例如,本實驗中若流速為20 滴/min,則流出液遇KI-I2溶液呈藍(lán)色。