王元欣 張磊 黑悅 魚洋 岳康異 武秀權(quán) 蔣曉帆*

(1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032; 2扶風(fēng)縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 寶雞 722200)

隨著世界老齡化的到來，腦卒中已成了主要“三大殺手”之一[1]。在我國，其中60%～70% 為缺血性腦卒中[2]，給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，國內(nèi)外越來越多的研究關(guān)注腦卒中后線粒體自噬的過程和其具體分子機(jī)制。自噬體上的標(biāo)志性蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule related protein-1 light chain-3, LC3)被作為檢測的標(biāo)志性分子；而作為帕金森病相關(guān)基因：同源性磷酸酶-張力蛋白誘導(dǎo)的激酶1(PTEN-induced putative kinase protein 1, Pink1)和帕金森蛋白(Parkin)介導(dǎo)線粒體自噬，在缺血性腦卒中中的表達(dá)和作用尚不清楚。本研究擬通過培養(yǎng)原代小鼠皮層神經(jīng)元，采用氧糖剝奪模型，進(jìn)一步明確線粒體自噬PINK1在不同時(shí)長氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation, OGD)后時(shí)空表達(dá)，為進(jìn)一步干預(yù)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、主要設(shè)備和材料

采用懷孕15～16 d的C57BL/6J清潔級孕鼠，購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。超凈工作臺(Artech)。兔源LC3B一抗、兔源β-Actin一抗(Gene Tex)；兔源PINK1一抗(Abcam)；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記二抗(中杉金橋)；0.25%胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、B27 神經(jīng)元培養(yǎng)添加劑、神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Neurobasal)、達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)(Gibco)等。

二、主要方法

1.原代神經(jīng)元培養(yǎng)：孕鼠頸椎脫臼處死，消毒后取出胎腦，顯微鏡下剝離胎鼠大腦皮層。虹膜剪剪碎，加入0.25 g/L胰蛋白酶消化液，置于37 ℃孵箱消化15～20 min，每5 min搖晃一次。三支離心管分別加DMEM+20%FBS 8 mL，將消化好的組織用玻璃管分別移至三支離心管來回洗滌，并輕輕吹打，靜置5 min后取上層培養(yǎng)液，分別接種于包被過的96孔、24孔、6孔塑料培養(yǎng)板中，4～6 h全量換液，2～3 d半量換液，待神經(jīng)元成熟做相應(yīng)處理。

2.體外培養(yǎng)神經(jīng)元缺血損傷的制作及分組：將神經(jīng)元培養(yǎng)液換成無糖DMEM培養(yǎng)基，并放置于37 ℃、95%氮?dú)狻?%CO2孵箱內(nèi)2 h、4 h、6 h、8 h，對照組不做任何處理，并在倒置顯微鏡下觀察缺血缺氧后神經(jīng)元狀態(tài)。

3.細(xì)胞活力測定：96孔板每孔加入20 μL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4, 5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3, 5-di-phenytetrazoliumromide, MTT]溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱37 ℃下孵育4 h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后再加入二甲基亞砜溶液，酶標(biāo)儀在490 nm測定吸光度(optical density, OD)值。以對照組細(xì)胞活力為100%，細(xì)胞存活率計(jì)算用下面的公式：細(xì)胞存活率(%) =(OD處理組/OD正常組)×100%。

4.WB檢測LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平變化：收集各組處理過的神經(jīng)元，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與LC3(1 ∶3 000)、PINK1(1 ∶1 000)、Parkin(1 ∶1 000)、β-Actin(1 ∶3 000)抗體結(jié)合，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，顯色壓片后使用掃描儀采集電子圖像信息分析。最后以目的蛋白與β-actin的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值之比作為其蛋白水平的相對量。

5.免疫熒光檢測PINK1空間表達(dá)：4%多聚甲醛固定20 min，驢血清室溫封閉30 min，加入一抗抗體(PINK1 1 ∶1 000)4 ℃過夜，加入驢抗兔熒光二抗抗體(1 ∶1 000)室溫孵育3 h，Hoechst染料染核5 min，熒光顯微鏡觀察、攝片。

結(jié) 果

一、細(xì)胞活力測定

以對照組存活率為100%，OGD 2 h組，細(xì)胞活性大幅度下降為64.9%±6.6%；OGD 4 h神經(jīng)元死亡率相對減少，存活率為54.7%±6.2%；OGD 6 h存活率為36.6%±6.0%；OGD 8 h組大量細(xì)胞死亡，存活率僅為31.8%±6.1%。表明不同時(shí)長的OGD損傷可造成細(xì)胞活性呈進(jìn)展性下降趨勢(P<0.01，圖1)。

圖1 不同時(shí)間ODG處理對小鼠皮層神經(jīng)元活性的影響

Fig 1 Effect of OGD treatment at different time points of on viability of mouse cortical neurons

aP<0.01,vsOGD 0 h.

二、WB檢測OGD后神經(jīng)元LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin表達(dá)

WB結(jié)果提示，LC3-Ⅱ在不同時(shí)長OGD后，較正常組均有所增高(圖2A)，在4 h時(shí)達(dá)到高峰，隨著OGD時(shí)長增加，表達(dá)下降。至8 h時(shí)，與正常組比較，LC3-Ⅱ無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PINK1在不同時(shí)長OGD后，表達(dá)較正常組均有增高，但6 h、8 h較正常組無顯著性差異，OGD 4 h與正常組比較有非常顯著差異(圖2B)。與正常組比較，OGD后Parkin表達(dá)呈整體下降趨勢，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2C)。

三、熒光免疫組化檢測PINK1表達(dá)的結(jié)果

Hoechst染色后，正常細(xì)胞核均質(zhì)、圓滿，清晰可見。ODG 4 h組，神經(jīng)元細(xì)胞核成波紋狀或折縫樣，部分細(xì)胞核固縮，OGD 8 h組可見大量細(xì)胞核裂解為碎塊及可見凋亡小體。PINK1在正常神經(jīng)元包漿中少量均勻分布，與OGD 0 h比較，OGD 4 h組PINK1熒光強(qiáng)度增加，可見大量散在紅色強(qiáng)點(diǎn)；OGD 8 h組PINK1包漿結(jié)構(gòu)消失，熒光強(qiáng)度相對減弱。見圖3。

圖2 WB法檢測ODG后不同時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin相對表達(dá)量

Fig 2 The relative expression of LC3-Ⅱ, PINK1 and Parkin at different time points after OGD treatment detected by WB

A: Statistical representation for the expression of LC3-Ⅱ; B: Statistical representation for the expression of PINK1; C: Statistical representation for the expression of Parkin.

aP<0.05;bP<0.01,vsOGD 0 h.

圖3 熒光顯微鏡檢測氧糖剝奪后不同時(shí)間點(diǎn)PINK1的表達(dá)(Hoechst, ×400)

Fig 3 Expression of PINK1 in OGD treated mouse cortical neurons at different time points detected by immunofluorescense microscopy (Hoechst, ×400)

A: Fluorescence expression of PINK1 in normal neurons; B: Fluorescence expression of PINK1 after ODG treatment for 4 h; C: Fluorescence expression of PINK1 after ODG treatment for 4 h.

討 論

最新研究提示，生理情況下，細(xì)胞存在低水平自噬，以維持細(xì)胞正常代謝及穩(wěn)態(tài)、內(nèi)環(huán)境。而在缺血再灌注損傷的早期，神經(jīng)元通過自噬消除功能異常的細(xì)胞器，減少能量消耗，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3-6]。LC3有4種亞型(LC3-Ⅰ～Ⅳ)，自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅱ蛋白聚集于自噬體膜上，其含量與自噬泡數(shù)量成正比，可作為檢測自噬的標(biāo)志。正常條件下，PINK1表達(dá)較低，在受損或去極化的線粒體上PINK1表達(dá)上調(diào)，通過其激酶活性，操縱下游的分子改變，促進(jìn)線粒體自噬[7]，而大量PINK1在受損的線粒體聚集，進(jìn)而招募Parkin由包漿轉(zhuǎn)位線粒體上，其E3泛素酶被激活，從而介導(dǎo)線粒體自噬[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型中，PINK1具有神經(jīng)元保護(hù)作用[9]，因此，PINK1變化可以評價(jià)線粒體自噬的誘導(dǎo)情況。

本實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，神經(jīng)元對缺氧敏感，隨著缺氧時(shí)間的延長，其存活率下降，OGD 2 h后神經(jīng)元出現(xiàn)大量死亡，與OGD 4 h相比，2 h與4 h的OGD死亡率未成等比例死亡。表明不同時(shí)長OGD對神經(jīng)元存在不同程度損傷。而結(jié)果提示LC3-Ⅱ在OGD 4 h表達(dá)最高，PINK1也在OGD 4 h時(shí)達(dá)到峰值，而Parkin蛋白表達(dá)水平下降。免疫熒光結(jié)果亦表明PINK1在OGD 4 h時(shí)熒光表達(dá)最強(qiáng)，并大量呈斑點(diǎn)狀表達(dá)于胞質(zhì)中。說明在此時(shí)，自噬體增加，線粒體自噬增強(qiáng)，大量自噬小體吞噬受損的線粒體。OGD時(shí)間越長，損傷程度越嚴(yán)重，細(xì)胞形態(tài)改變越明顯，神經(jīng)元死亡數(shù)量越多。陳璐勔等[10]研究認(rèn)為，OGD可誘發(fā)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元自噬發(fā)生，且細(xì)胞自噬可緩解OGD處理腦皮質(zhì)神經(jīng)元的缺血損傷。彭程等[11]通過應(yīng)用線粒體分裂抑制劑(Mdivi-1)，抑制自噬的發(fā)生，從而加重了神經(jīng)元損傷。因此我們認(rèn)為，自噬既可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，也可以通過自噬保護(hù)細(xì)胞，減少細(xì)胞的死亡。線粒體自噬的激活可拮抗神經(jīng)元缺血損傷，損傷4 h內(nèi)可能是對抗缺血損傷的最佳時(shí)機(jī)。

腦卒中發(fā)生后，時(shí)間是緊急救治的關(guān)鍵，同時(shí)神經(jīng)元所處的微環(huán)境通過多種微環(huán)境影響其存活，作為神經(jīng)元“能量工廠”的線粒體，其PINK1作為缺血性腦卒中后潛在干預(yù)靶點(diǎn)，有待于我們進(jìn)一步去研究。

參 考 文 獻(xiàn)

1GO A S, MOZAFFARIAN D, ROGER V L, et al. Heart disease and stroke statistics-2014 update: a report from the American Heart Association [J]. Circulation, 2014, 129(3): e28-e292.

2DONNAN G A, FISHER M, MACLEOD M, et al. Stroke [J]. Lancet, 2008, 371(9624): 1612-1623.

3BALDUINI W, CARLONI S, BUONOCORE G. Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury: evidence and speculations [J]. Autophagy, 2009, 5(2): 221-223.

4BALDUINI W, CARLONI S, BUONOCORE G. Autophagy in hypoxia-ischemia induced brain injury [J]. J Matern Fetal Neonatal Med, 2012, 25(Suppl 1): 30-34.

5CARLONI S, BUONOCORE G, BALDUINI W. Protective role of autophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury [J]. Neurobiol Dis, 2008, 32(3): 329-339.

6劉雪, 王楓, 熊利澤. 自噬在急性腦損傷的研究進(jìn)展 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2017, 16(4): 371-373.

7JIN S M, YOULE R J. PINK1- and parkin-mediated mitophagy at a glance [J]. J Cell Sci, 2012, 125(Pt 4): 795-799.

8NARENDRA D P, JIN S M, TANAKA A, et al. PINK1 is selectively stabilized on impaired mitochondria to activate Parkin [J]. PLoS Biol, 2010, 8(1): e1000298.

9ZHAO Y, CHEN F, CHEN S, et al. The parkinson's disease-associated gene PINK1 protects neurons from ischemic damage by decreasing mitochondrial translocation of the fission promoter Drp1 [J]. J Neurochem, 2013, 127(5): 711-722.

10陳璐勔, 羅艷琳, 趙麗, 等. 細(xì)胞自噬緩解氧-糖剝奪誘導(dǎo)原代培養(yǎng)小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元缺血損傷 [J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2014,34(12): 1611-1615.

11彭程, 張磊, 饒維, 等. 線粒體分裂抑制劑通過抑制自噬加重OGD/R損傷 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2015, 15(2): 101-104.