汪林慶 王 航 陳亞東， 楊 光 白 莉 孫璐明 沙珍霞，

(1. 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 福州 350116； 2. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 青島 266071； 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室， 青島 266235)

魚類是最早具有獲得性免疫系統(tǒng)的脊椎動物，獲得性免疫功能依賴于T、B淋巴細胞2個亞群[1，2]。目前， 分離魚類免疫細胞比較常見的是密度梯度離心法[3，4]， 但是對T、B淋巴細胞的分離和鑒定還缺乏有效的手段。根據(jù)B細胞表面凹凸不平， 而T細胞表面微絨毛多較光滑的細胞特性， 尼龍毛法成功應(yīng)用在哺乳動物T、B淋巴細胞的分離上， 一些學(xué)者利用尼龍毛法在魚類上也成功分離了淋巴細胞[5，6]。T細胞受體(T cell receptor， TCR)是一種非常重要的T細胞抗原識別受體[7]， 大多數(shù)T細胞的TCR由α和β肽鏈組成， 少數(shù)T細胞的TCR由γ和δ肽鏈組成[8]。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus)， 是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類， 但日益頻發(fā)的病害影響了養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展， 對半滑舌鰨免疫機制的解析是病害防治的根本途徑之一。鑒于多數(shù)魚類上尚缺乏有效的淋巴細胞分離、培養(yǎng)和鑒定技術(shù)， 本文通過開展外周血T淋巴細胞的分離和鑒定， 以期為利用體外分離和短期培養(yǎng)的T淋巴細胞開展免疫基因功能研究提供細胞平臺；同時通過對TCRβ基因的組織表達和免疫應(yīng)答趨勢進行分析， 對半滑舌鰨獲得性免疫研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

半滑舌鰨購自日照東鑫現(xiàn)代漁業(yè)技術(shù)研究所，魚齡為1.5齡左右， 平均體重(310±5) g， 平均體長(30.6±0.1) cm。健康實驗魚在24℃水箱中暫養(yǎng)7d，以消除環(huán)境脅迫。

1.2 主要試劑

Hank’s緩沖液(Solarbio， 北京)， 淋巴細胞分離液(Gibco， 美國)， Ficoll-400(Solarbio， 北京)， 瑞氏染液(Solarbio， 北京)， 鼠抗人FITC-CD3單克隆抗體，鼠抗人FITC-CD19單克隆抗體， MTT (3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)(Sigma， 美國)， 植物凝集素PHA (Sigma， 美國)， 臺盼藍， 尼龍毛。

DMEM完全培養(yǎng)基: DMEM基本培養(yǎng)基中添加15%FBS (胎牛血清， Gibco， 美國)， 1 mmol/L的丙酮酸鈉， 50 mmol/L的 2-Me (2-巰基乙醇)， 100 U/mL的青霉素， 100 U/mL的鏈霉素， 0.3 μg/mL的PHA，培養(yǎng)基pH為 7.0—7.3。

1.3 半滑舌鰨外周血淋巴細胞的分離

將人淋巴細胞分離液用Ficoll-400調(diào)整密度為1.080， 用于半滑舌鰨外周血白膜層細胞的分離。先將半滑舌鰨置于冰水中麻醉， 用70%酒精棉球擦拭體表， 使用肝素抗凝管抽取尾靜脈外周血， 立刻混勻， 在超凈工作臺中將全血與Hank’s緩沖液1∶3稀釋混勻， 取分離液各3 mL于15 mL離心管中， 再各取2 mL稀釋血液緩緩置于分離液液面上， 水平離心機1000 r/min離心20min， 收集白膜層細胞， 加入5倍體積的Hank’s緩沖液洗2次， 1000 r/min離心5min收集細胞沉淀， 重懸于DMEM完全培養(yǎng)基， 24℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后收集上層懸浮細胞， 0.2%臺盼藍活性計數(shù)。調(diào)整細胞濃度為6×105個/mL進行后續(xù)培養(yǎng)。

1.4 淋巴細胞體外代謝活力的檢測

將密度為6×105個/mL懸浮淋巴細胞接種在含有0.3 μg/mL PHA的DMEM完全培養(yǎng)基中， 用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)， 培養(yǎng)溫度為24℃。分別在0、6h、12h、18h、24h、36h、48h加入50 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。洗掉MTT溶液后， 每孔加150 μL DMSO， 平板搖床緩緩搖動10min， 采用酶標儀檢測570 nm波長處每孔細胞的光密度， 重復(fù)3次。

1.5 淋巴細胞的進一步分離

用1%HCl浸泡尼龍毛， 煮沸5—10min， 加蒸餾水沖洗直至溶液呈中性， 室溫晾干， 將尼龍毛梳理開， 使其無結(jié)； 5 mL注射器移去活塞， 裝入0.4 g尼龍毛， 壓實， 鋁箔包好管口高壓蒸汽滅菌。完全DMEM培養(yǎng)基流過注射筒并沒過尼龍毛， 封住下出口， 直立于24℃培養(yǎng)箱孵育≥45min。打開下出口流出培養(yǎng)基， 將收集的淋巴細胞稀釋到107個/mL， 加1 mL細胞懸液， 封閉出口， 再加2—3 mL DMEM完全培養(yǎng)基， 24℃培養(yǎng)箱直立孵育45min。打開下出口， 收集最初流出的非黏附細胞， 關(guān)閉出口加入0.7%冰冷生理鹽水， 震蕩， 套上活塞， 推出液體， 收集黏附細胞， 0.2%臺盼藍檢測細胞活性。

1.6 T樣、B樣淋巴細胞的鑒定

將收集的黏附細胞和非黏附細胞分別培養(yǎng)， 并與50 μL鼠抗人FITC-CD3、FITC-CD19單克隆抗體混勻， 4℃靜置 30min， 洗棄上清， 流式細胞儀分別檢測其特異結(jié)合率， 與鼠抗人FITC-CD3結(jié)合的為T樣淋巴細胞， 與鼠抗人FITC-CD19結(jié)合的為B樣淋巴細胞。

1.7 T細胞的鑒定

分別收集黏附細胞和非黏附細胞， 用于RNA提取。RNA提取按照RNA提取試劑盒(天根， 北京)說明書進行操作。cDNA第一條鏈的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物， 大連)說明書進行， 得到的cDNA在–20℃保存待用。根據(jù)已發(fā)表的半滑舌鰨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[9]中的TCR基因序列信息(XM_017043019.1)， 設(shè)計特異性引物T1-F和T1-R (表 1)進行PCR擴增(目的片段長度為760 bp左右)， 經(jīng)測序驗證獲得了TCRβ的基因序列， 根據(jù)測序得到的半滑舌鰨TCRβ基因序列設(shè)計qRT-PCR引物為qT1-F、qT1-R (目的片段長度為216 bp)(表 1)。分別以非黏附細胞和黏附細胞為模板， 用T1-F和T1-R引物對、qT1-F、qT1-R引物對進行PCR擴增。

1.8 半滑舌鰨組織的收集

感染實驗參照孫璐明等[10]方法略作修改， 采取實驗室自行分離鑒定的鰻弧菌(Vibrio anguillarum)，菌體為桿狀或弧狀， 單鞭毛， 革蘭氏陰性菌， 氧化酶陽性， 過氧化氫酶陽性， 葡萄糖發(fā)酵陽性， 對弧菌抑制劑敏感， 具有極強的致病性。在28℃， 2216E液體培養(yǎng)基中進行擴培。按照3.18×105CFU/g (半數(shù)致死量，LD50)對健康半滑舌鰨進行腹腔注射； 對照組注射同等體積1×PBS緩沖溶液。在注射后的0、6h、12h、24h、48h、72h 6個時間點取樣， 每個時間點設(shè)置3個平行樣， 分別取肝、小腸、脾、頭腎、鰓、血液6種基本免疫組織； 另外隨機選3條健康魚分別收集肝、脾、頭腎、后腎、小腸、胃、血液、鰓、皮膚、肌肉、心臟、腦、卵巢13個組織， 所取組織迅速投入液氮中凍存， 用于RNA提取和cDNA制備。

表 1 半滑舌鰨TCRβ基因克隆和表達分析所用引物Tab. 1 Primers used for expression analysis and cloning of TCRβ in C. semilaevis

1.9 半滑舌鰨TCR基因?qū)崟r定量分析

以各組織cDNA為模板， 設(shè)計qRT-PCR引物為qT1-F、qT1-R (表 1)， 以半滑舌鰨18S rRNA基因為內(nèi)參， 設(shè)計引物為Cs18S-F、Cs18S-R (表 1)。用SYBR Green熒光定量試劑盒(天根， 北京)按照說明書在ABI PRISM 7500Fast實時定量擴增儀上進行qRT-PCR反應(yīng)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對qRT-PCR檢測結(jié)果進行分析。實時定量數(shù)據(jù)用3組重復(fù)平均值±標準誤(SE)表示， 使用2–ΔΔCt法計算相對表達量。采用單因素方差分析法中的Duncan法對多組樣本均數(shù)進行兩兩比較分析，P＜0.05時， 認為存在顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨外周血淋巴細胞的分離

外周血經(jīng)水平離心機離心20min后， 分為明顯的5層， 從下至上分別為紅細胞層、粒細胞層、分離液層、白膜層和血漿層(圖 1)。白膜層中包含淋巴細胞和單核/巨噬細胞。收集白膜層細胞， 洗滌兩次后接種到DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h， 單核/巨噬細胞貼壁， 收集懸浮的淋巴細胞(圖 2)。在倒置顯微鏡下觀察， 淋巴細胞呈圓形， 直徑6—8 μm左右， 瑞氏染色發(fā)現(xiàn)核質(zhì)比較大， 細胞核呈圓形， 幾乎占據(jù)整個細胞， 具有典型的淋巴細胞形態(tài)特征(圖3)， 0.2%臺盼藍檢測細胞活性， 活細胞百分率大于85%。

圖 1 密度為1.080 mg/mL的分離液分離效果Fig. 1 The result of separating blood of founder with density of 1.080 mg/mL

2.2 淋巴細胞體外代謝活力生長曲線

實驗結(jié)果表明， 在有絲分裂原PHA的刺激下，半滑舌鰨外周血淋巴細胞個體變大， 在體外可以增殖(圖 4)， 在培養(yǎng)12—24h之后細胞細胞增殖迅速，隨后細胞不再增殖， 細胞數(shù)量慢慢減少， 24—48h后細胞數(shù)量保持相對穩(wěn)定。體外培養(yǎng)條件下淋巴細胞不貼壁， 呈懸浮狀態(tài)， 細胞間相互黏連聚集呈葡萄串狀(圖 5)。

圖 2 100倍鏡下的懸浮淋巴細胞Fig. 2 Suspending lymphocytes under the microscope (100×)

圖 3 淋巴細胞瑞氏染色(100倍油鏡)Fig. 3 Lymphocyte Wright's staining (100-fold oil mirror)

圖 4 半滑舌鰨外周血淋巴細胞生長曲線Fig. 4 The growth curve of peripheral blood lymphocyte of C.Semilaevis

2.3 黏附細胞和非黏附細胞的鑒定

對黏附細胞和非黏附細胞采用流式細胞儀結(jié)合單克隆抗體進行檢測。結(jié)果表明， 非黏附細胞與鼠抗人FTIC-CD3單克隆抗體的結(jié)合率為3.18%， 黏附細胞不與鼠抗人FTIC-CD3單克隆抗體結(jié)合，CD3分子在哺乳動物中被證實是T淋巴細胞表面抗原， 因此可以認為分離的半滑舌鰨外周血淋巴細胞中的非黏附細胞為T樣淋巴細胞。同樣， 黏附細胞和鼠抗人FTIC-CD19單克隆抗體的結(jié)合率為7.87%，非黏附細胞不與該抗體結(jié)合， 而CD19在哺乳動物中被認定為B淋巴細胞的表面抗原， 因此黏附細胞證明為半滑舌鰨B樣淋巴細胞。為進一步確認淋巴細胞的特性， 將分離的2種細胞分別用TCRβ基因克隆驗證。由于TCRβ在T細胞表面特異表達， 而在B細胞表面不表達， 通過2對不同引物的擴增(T1-F/R和qT1-F/R)， 在非黏附細胞中分別獲得了760和261 bp左右的PCR擴增產(chǎn)物， 在黏附細胞中檢測不到TCRβ基因的表達， 表明收集的非黏附細胞是T淋巴細胞。

2.4 半滑舌鰨TCRβ基因在健康組織的表達

TCRβ基因在13個健康組織中均有表達(圖 6)，在腸中相對表達量最高(12.22)， 其次是胃(9.09)、脾臟(8.17)， 在頭腎、后腎、皮膚和鰓中也有較高的表達量， 在肌肉和腦中的表達量相對低(肌肉0.13、腦0.57)， 說明TCRβ基因在不同組織中存在表達差異性。

2.5 半滑舌鰨感染鰻弧菌后TCRβ基因在免疫組織中的表達

鰻弧菌感染半滑舌鰨后0、6h、12h、24h、48h、72h和96h，TCRβ基因在不同時間點6種免疫組織(肝、脾、頭腎、鰓、腸和血液)中呈現(xiàn)出不同的表達水平(圖 7)。結(jié)果表明: 在肝和脾中TCRβ基因的表達呈現(xiàn)相同的上調(diào)趨勢， 其表達峰值出現(xiàn)在鰻弧菌感染后96h， 在肝中為對照組表達量的27.4倍；在脾臟中則是對照組的21.7倍； 在鰓中TCRβ基因表達上調(diào)， 最大表達量出現(xiàn)在感染后72h， 是對照組的11.5倍， 96h時依然保持較高的表達水平； 在頭腎、血液和腸中的表達量變化不大， 在頭腎中下調(diào)或上調(diào)表達量在2倍左右； 在血液中表達的最低值出現(xiàn)在12h， 為對照組的0.02倍， 其表達的趨勢為先下降后上升， 48h基本恢復(fù)到正常表達水平。在腸中鰻弧菌感染后6h表達量增加了3倍， 但隨后的各時間點TCRβ基本處于下調(diào)表達狀態(tài)。

圖 5 淋巴細胞體外懸浮培養(yǎng)Fig. 5 Suspension culture of lymphocytes

圖 6 TCRβ基因在半滑舌鰨健康組織中的相對表達量Fig. 6 The relative expression of TCRβ gene in normal tissues of C. semilaevis

3 討論

3.1 T淋巴細胞的分離鑒定

采用密度梯度離心方法進行魚類外周血淋巴細胞的分離已經(jīng)有很多成功的報道。早在20世紀80年代， Sakai[5]用18% Ficoll溶液分離得到金魚(Carassius auratus)和鱒(Salmo playtcephalus)淋巴細胞， Blaxhall[4]用Ficoll-paque或Percoll梯度離心法分離了河鮭(Satmo truttaL.)、鯉(Cyprinus carpio)外周血淋巴細胞。但是由于魚類的多樣性比較高，不同魚類所用分離液的密度有所不同。本實驗對淋巴細胞分離方法進行了改進， 建立了適用于半滑舌鰨外周血淋巴細胞的分離方法。這一結(jié)果與報道的物種如鯉、金魚等淋巴細胞分離結(jié)果相似。

圖 7 鰻弧菌感染半滑舌鰨后不同時間點6種組織(肝、脾、頭腎、鰓、腸和血液)中TCRβ基因的相對表達水平Fig. 7 Relative expression of TCRβ gene in six tissues (liver， spleen， head kidney， gills， intestine and blood) of C. semilaevis at different time points after Vibrio anguillarum infection

體外培養(yǎng)的淋巴細胞不易傳代生長， 而適當濃度的PHA (植物血凝素)可以促進淋巴細胞體外生長， 使之成功分裂增殖。如Fujiwara等[11]用含有18 μg/mL PHA的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)外周血淋巴細胞可達6d并用于染色體組型實驗。本文采用含有PHA終濃度為0.3 μg/mL的完全DMEM培養(yǎng)基， 對分離獲得的半滑舌鰨外周血淋巴細胞成功實現(xiàn)了體外培養(yǎng)， 淋巴細胞在18h后增殖達到對數(shù)期， 且穩(wěn)定的增殖狀態(tài)可維持48h。

在魚類上， 目前由于缺少特異抗體， 對淋巴細胞的類群劃分還存在比較大的困難。但隨著基因組學(xué)的發(fā)展， 通過細胞表面特異基因的檢測已成為鑒定淋巴細胞的有效手段。魚類淋巴細胞表面標記的研究處于初級階段， 利用現(xiàn)有的單抗分離的淋巴細胞往往并不是單一的細胞亞群[12—14]。尼龍毛法是分離魚類T、B淋巴細胞的有效手段， Tate[15]通過尼龍毛法收集了對PHA、ConA敏感的魚類非黏附細胞及對LPS敏感的黏附細胞。Xia等[5]用尼龍法分離鰻鱺(Anguilla japonica)淋巴細胞， 發(fā)現(xiàn)黏附性細胞具有B淋巴細胞有絲分裂反應(yīng)特性， 而非黏附性細胞有T淋巴細胞有絲分裂特性。本研究結(jié)果表明， 尼龍毛法同樣適用于半滑舌鰨外周血淋巴細胞的分離。目前， CD3[16，17]和CD19分別被認定為B淋巴細胞T淋巴細胞的表面抗原分子[18—20]。通過蛋白序列比對得知， 半滑舌鰨CD3(NCBI:NO XP_008306806.1)與人CD3(NCBI:NO XP_016874032.1)蛋白序列相似性為29%； 半滑舌鰨CD19(本實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù))與人CD19(NCBI:NO XP_016874032.1)蛋白序列的相似性為44%左右。另外， 人類的CD3和CD19抗體已經(jīng)成功的應(yīng)用于多種水生動物的淋巴細胞鑒定， 如中華鱉(Trionyx Sinensis)[21]， 海星(Asteroidea)[22]等。根據(jù)T淋巴細胞表面特異CD3分子標記和B淋巴細胞表面特異的CD19分子標記， 利用流式細胞儀檢測到半滑舌鰨外周血中非黏附淋巴細胞和黏附淋巴細胞與鼠抗人FTIC-CD3單抗和鼠抗人FTIC-CD19單抗結(jié)合效率分別為3.18%和7.87%。且由于TCRβ在T細胞特異性表達，而在B細胞不表達， 本實驗表明收集的非黏附細胞是T淋巴細胞， 黏附細胞是B淋巴細胞。目前應(yīng)用TCR的表達鑒定魚類的T細胞的方法在斑馬魚(Barchydanio reriovar)、大西洋鱈(Gadus morhua)等魚類上亦有報道[23，24]。

3.2 TCRβ基因的表達特征分析

T細胞受體(TCR)作為T細胞識別內(nèi)/外源性抗原的分子， 在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用。自20世紀 80 年代T細胞受體基因被先后發(fā)現(xiàn)和克隆以來[25，26]， 關(guān)于T細胞受體與機體獲得性免疫[27]、自身免疫性疾病[28]、淋巴系統(tǒng)腫瘤[29]以及與病原分子[30]相互識別的關(guān)系得到了廣泛的研究。目前， 人和鼠的T細胞受體的研究較多， 而對魚類等動物TCR分子結(jié)構(gòu)與功能研究較少。本研究表明，TCRβ在半滑舌鰨各個健康組織中都有表達，在腸道中的表達最高， 在胃、頭腎、后腎和脾中的表達相對其他組織也較高。腸是最大的免疫器官，腸上分布著大量的腸相關(guān)淋巴組織(Gut associated lymphoid tissues， GALTs)， 頭腎、脾臟是魚類的系統(tǒng)免疫器官， 也含有大量的T細胞， 故表達量較高。感染鰻弧菌后TCRβ在肝、脾、鰓中的表達量上調(diào)趨勢明顯， 且表達的峰值基本出現(xiàn)在72—96h。本研究結(jié)果說明TCRβ以在病原刺激后， 參與了機體的獲得性免疫應(yīng)答。TCRβ基因在鰻弧菌刺激后在腸中的表達變化幅度不大， 僅在感染6h后出現(xiàn)了小幅上調(diào)表達， 12h后則呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢， 可能與采用腹腔注射的感染方式有關(guān)。腸道是最早接觸病原菌的組織， 因此在腹腔注射導(dǎo)致腸道感染后的短時間內(nèi)， 免疫細胞在腸道富集， 導(dǎo)致腸道中在感染后的6h內(nèi)TCRβ表達量提高； 隨后， 病原菌進入其他組織， 激活其他免疫組織該基因的表達。這一點可以通過其他組織普遍在感染后的48h表達量上升得到印證， 感染鰻弧菌后TCRβ在肝、脾、鰓中的表達量上調(diào)趨勢明顯， 且表達的峰值基本出現(xiàn)在72—96h。

本研究通過密度梯度離心和短期細胞培養(yǎng)方法， 結(jié)合尼龍毛法、流式細胞儀成功分離、鑒定了半滑舌鰨外周血T樣淋巴細胞和B樣淋巴細胞， 并進一步通過T細胞特異表面受體基因TCRβ表達對T細胞進行了鑒定； 這為后續(xù)半滑舌鰨免疫學(xué)研究建立了奠定了良好的細胞學(xué)基礎(chǔ)。同時通過檢測TCRβ基因在健康組織中、病原刺激后不同的免疫組織中基因的表達變化趨勢， 驗證了TCRβ基因在機體獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮的重要作用。

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