金利容,萬 鵬，黃 薇

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院 植保土肥研究所/湖北省農(nóng)作物重大病蟲草害可持續(xù)控制重點實驗室，湖北 武漢 430064)

黃萎病是棉花生產(chǎn)上的一種重要病害，為大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.) 引起的土傳病害，能導致棉花嚴重減產(chǎn)甚至植株死亡，已成為棉花生產(chǎn)的主要限制因子之一[1]。生物防治由于其對環(huán)境的友好性被認為是一種頗具應(yīng)用前景的方法，利用微生物對棉花黃萎病進行防治，能在改善作物生長和產(chǎn)量的同時確保自然環(huán)境的安全性，具有可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略意義。

利用生防細菌防治棉花黃萎病，研究較為深入的主要有芽孢桿菌(Bacillusspp.)和假單胞桿菌(Pseudomonasspp.)。其中，芽孢桿菌包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[2-3]和蜂房芽孢桿菌(Paenibacillusalvei)[4-5]。Lu等[6]和李社增等[7]報道，枯草芽孢桿菌NCD-2菌株對棉花黃萎病防效顯著，田間防效在70%以上。關(guān)于假單胞桿菌對黃萎病的生防效果和生防機制的研究報道也較多[8-10]。目前，國內(nèi)研究較多并已經(jīng)規(guī)?；a(chǎn)的一個例子是枯草芽孢桿菌制劑，其生物防治的作用機制主要是通過產(chǎn)生桿菌肽等多種抗菌物質(zhì)來抑制病原菌[11]。但是總體而言，應(yīng)用在生產(chǎn)上的生防制劑還是較少，因此，有必要發(fā)掘?qū)γ藁S萎病防治更加有效和豐富的菌種資源，為棉花黃萎病的生物防治提供材料，并為將來生物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

植物內(nèi)生菌是自然界中非常豐富且龐大的菌種資源庫，是指那些生活史特定階段或全部階段寄生在健康植物組織內(nèi)的微生物，且在長期的發(fā)展歷程中已經(jīng)與植物建立起了一種彼此協(xié)助、互惠共利的相互關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)不可缺少的天然組成成分。植物內(nèi)生菌具有豐富的利用價值，很多內(nèi)生菌對植物具有促生和防病作用，利用植物內(nèi)生菌作為生防菌來控制植物病原菌具有巨大潛力[12]，是植物保護的一個重要發(fā)展方向。

在前期研究中，從棉花組織分離出大量的內(nèi)生細菌，經(jīng)初篩，得到1株對棉花黃萎病抑制效果較好的生防細菌HB3S-20。本試驗進一步對該菌的溫室與大田防治效果進行研究，并對該菌進行了室內(nèi)抑菌活性測定以及菌株鑒定，探究其作為棉花黃萎病生防菌株的潛力。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和棉花品種

內(nèi)生細菌HB3S-20是從棉花莖部分離并通過溫室試驗初篩獲得的1株內(nèi)生細菌，于-80 ℃保存。落葉型大麗輪枝菌菌株V991b由本實驗室-80 ℃保存。棉花品種為常規(guī)棉感病品種冀棉11。

1.2 菌株HB3S-20對棉花黃萎病的溫室生防效果測定

將脫絨的冀棉11的種子用無菌水浸泡12 h，種入營養(yǎng)基質(zhì)(從中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所購買的無土育苗基質(zhì)，與河砂以1∶1等體積混合)中，待棉苗長出1～2片真葉，將整株棉苗輕輕從營養(yǎng)基質(zhì)中移出，待接種用。將大麗輪枝菌菌株V991b活化后，接入到查氏培養(yǎng)基，25 ℃、150 r/min搖菌培養(yǎng)7 d，用4層紗布過濾獲得孢子液，調(diào)整濃度至1×107個/mL。對菌株HB3S-20進行活化，挑單菌落于裝有5 mL NB培養(yǎng)基的大試管中培養(yǎng)過夜，然后將1 mL的菌液加入到含50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中擴大培養(yǎng)，28 ℃、150 r/min搖菌培養(yǎng)3 d，將搖培后的菌液6 000 r/min離心10 min,去掉上清，將菌體沉淀用無菌水溶解，調(diào)整濃度至1×108個/mL，即為HB3S-20菌液。

將大麗輪枝菌孢子液與HB3S-20菌液等體積混合接種棉苗的根部即浸根處理20 min，以用大麗輪枝菌孢子液加等體積無菌水接種棉苗根部為陽性對照，以無菌水接種棉苗根部為陰性對照，均設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)15株棉苗。然后將棉苗移栽到一次性塑料缽(直徑為10 cm)中，每個缽中3株，溫室溫度保持在25～30 ℃，并隔天澆一次水，保持合適的濕度。

接種后15 d開始調(diào)查，每5 d調(diào)查一次，即接種后15、20、25、30 d分別調(diào)查發(fā)病情況，按5級標準記載發(fā)病嚴重度[13]。0級：健株,無癥狀；1級：1～2片子葉發(fā)病或者1片真葉輕微發(fā)??；2級：1片真葉嚴重發(fā)??；3級：2片以上真葉發(fā)病或脫落，僅剩心葉；4級：植株生長點死亡或全株枯死。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，用以下公式計算病情指數(shù)和防治效果。

病情指數(shù)=(0×n0+1×n1+2×n2+3×n3+4×n4)/(N×4)×100

防治效果=(CKDI-HtDI)/CKDI×100%

公式中，n0、n1、n2、n3、n4分別表示不同病級的病株數(shù)，N表示統(tǒng)計的總株數(shù)，CKDI表示接種后30 d陽性對照的病情指數(shù)，HtDI表示接種后30 d菌株HB3S-20處理后的病情指數(shù)。

1.3 菌株HB3S-20對棉花黃萎病的田間生防效果評估

大田防治試驗于2015年進行，地點設(shè)在湖北潛江的一塊農(nóng)戶用地。此田塊屬于棉花連作地，棉花黃萎病常年發(fā)病嚴重。棉花品種為鄂棉24。4月中旬進行營養(yǎng)缽育苗，4月底移栽，移栽時處理組用HB3S-20菌液(濃度為1×108個/mL)對苗床進行灌根處理，用量約10 mL/株。對照組用自來水對苗床進行灌根處理。處理組和對照組均設(shè)3個小區(qū)，每個小區(qū)大約有90株棉花，各重復(fù)小區(qū)進行隨機排列。待發(fā)病高峰期調(diào)查棉花發(fā)病情況。田間棉花黃萎病嚴重度分級標準為：0級—棉株健康，無病葉，生長正常；1級—棉株1/4以下的葉片顯癥狀；2級—棉株1/4以上、1/2以下的葉片顯癥狀；3級—棉株1/2以上、3/4以下的葉片顯癥狀；4級—棉株3/4以上的葉片顯癥狀，或葉片全部脫落，棉株枯死。根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.4 菌株HB3S-20的形態(tài)鑒定和分子鑒定

活化菌株HB3S-20，將菌株HB3S-20菌液在NA培養(yǎng)基上劃線形成單菌落，觀察并記錄其形態(tài)特征，用移液槍吸取少量菌液均勻涂布在玻片上，在油鏡下觀察菌株HB3S-20的細胞形態(tài)。挑取活化的菌株HB3S-20單菌落接入裝有5 mL NB培養(yǎng)基的大試管中，150 r/min、28 ℃搖菌培養(yǎng)3 d，用細菌DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取菌株DNA并檢測其濃度和純度。以細菌DNA為模板，利用16S rDNA通用引物27F/1492R(27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增[14]。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。通過凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果(大小約為1 400 bp)。將PCR擴增產(chǎn)物送北京奧科生物公司純化和測序，之后與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast比對。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)菌株的16S rDNA序列，用 Mega 5.1 軟件進行序列分析，采用鄰接法(Neighbor-joining， NJ 法)進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和同源性比較，并將所測 16S rDNA序列提交GenBank注冊。

1.5 菌株HB3S-20對大麗輪枝菌菌絲生長的影響測定

采用平板對峙法測定。大麗輪枝菌V991b 在PDA平板上活化3 d后,在其菌落邊緣區(qū)域用打孔器(直徑6 mm)打孔制成菌片，轉(zhuǎn)接在新的PDA平板中央，25 ℃下培養(yǎng)4 d后(大麗輪枝菌生長緩慢)，在距V991b 菌株邊緣15 mm處的4個角點加20 μL的HB3S-20菌液，設(shè)空白對照(在4個角點加無菌水)，每個處理3個重復(fù)。 25 ℃對峙培養(yǎng)7 d,測量7 d內(nèi)V991b的菌落生長直徑,即用繼續(xù)培養(yǎng)7 d后V991b的菌落直徑減去之前培養(yǎng)4 d的菌落直徑，并按照下列公式計算抑菌率。

抑菌率=(對照V991b 7 d內(nèi)的菌落生長直徑-處理V991b 7 d內(nèi)的菌落生長直徑)/對照V991b 7 d內(nèi)的菌落生長直徑×100%。

1.6 菌株HB3S-20產(chǎn)生嗜鐵素的定性檢測

按照Schwyn等[15]的方法，配制CAS(鉻天青S)固體檢測培養(yǎng)基。將菌株HB3S-20接種在CAS固體培養(yǎng)基上，以大腸桿菌(E.coli)作為對照，置于28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，觀察菌落周圍的顏色變化。

1.7 菌株HB3S-20對棉花發(fā)芽率和棉株生長的影響測定

以感病品種冀棉11為供試品種，將種子置于HB3S-20菌液(濃度為1×108個/mL)中浸泡14 h后，種入營養(yǎng)基質(zhì)中，以無菌水浸泡的冀棉11種子作為對照。處理和對照分別準備150粒脫絨種子。3 d后計算其出苗率,20 d后測定15株棉苗的根長、株高以及鮮質(zhì)量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel處理，采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HB3S-20對棉花黃萎病的溫室生防效果

在溫室條件下對菌株HB3S-20的生防效果進行評價，結(jié)果表明，溫室條件下菌株HB3S-20對棉花黃萎病具有較好的防控效果，菌株HB3S-20與黃萎病菌V991b孢子液混合接種后30 d 3次重復(fù)試驗的平均病情指數(shù)分別為28.33、28.57和30.00，而僅接種黃萎病菌孢子液30 d的平均病情指數(shù)分別為70.83、73.33和90.00，HB3S-20對棉花黃萎病表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的防效，平均防效為62.57%(表1)。無菌水接種的處理未發(fā)病。

表1 HB3S-20對棉花黃萎病的溫室防效

注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著,下同。

2.2 菌株HB3S-20對棉花黃萎病的大田生防效果

通過采用移栽時灌根處理的方式進行菌株HB3S-20對棉花黃萎病的田間防治試驗，結(jié)果表明，菌液灌根處理能夠減輕棉花黃萎病的發(fā)生，對照的病株率和病情指數(shù)分別為22.18%和8.36，而移栽時菌液灌根處理的病株率和病情指數(shù)分別為11.28%和3.79，防效為54.67%(表2)。

表2 HB3S-20對棉花黃萎病的大田防效

2.3 菌株HB3S-20的鑒定結(jié)果

菌株HB3S-20的菌落形態(tài)為圓形，淡黃色，不透明。革蘭氏染色表明，菌株HB3S-20為革蘭氏陰性菌，在油鏡下觀察其細胞形態(tài)為卵圓形(圖1A、B)。菌株HB3S-20生長的最適溫度為25～30 ℃，41 ℃不生長。以菌株HB3S-20的DNA為模板，以16S rDNA通用引物27F/1492R為引物，擴增出菌株HB3S-20的16S rDNA部分序列(圖2)，對PCR產(chǎn)物進行純化和測序后，獲得該菌株16S rDNA序列的長度為1 400 bp，GenBank注冊號為 MF073238。并與假單胞菌屬的其他種及其相近種的16S rDNA序列進行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，此菌株的16S rDNA序列與假單胞菌屬的其他種及其相近種之間具有高度同源性,其中與惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的同源性最高,達99%，在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一分支,進化上的遺傳距離最近(圖3)。推測菌株HB3S-20為惡臭假單胞菌。

A：菌株HB3S-20的菌落形態(tài)；B：菌株HB3S-20的細胞形態(tài)(100×)；C：大麗輪枝菌V991b的單獨培養(yǎng)；D：菌株HB3S-20與大麗輪枝菌V991b的對峙培養(yǎng)圖1 菌株HB3S-20的形態(tài)特征及其對大麗輪枝菌V991b生長的抑制作用

圖2 菌株HB3S-20 16S rDNA擴增片段的電泳檢測

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株HB3S-20系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 菌株 HB3S-20對大麗輪枝菌V991b生長的抑制作用

在PDA培養(yǎng)基上，菌株HB3S-20和大麗輪枝菌V991b對峙培養(yǎng)時，能夠形成明顯的抑菌帶(圖1C、D)，表明菌株HB3S-20對大麗輪枝菌的生長具有拮抗作用，其抑菌率為47.30%(表3)。

2.5 菌株HB3S-20產(chǎn)生嗜鐵素的定性檢測結(jié)果

定性測定嗜鐵素所用的培養(yǎng)基是CAS培養(yǎng)基。CAS培養(yǎng)基中含有 CAS、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)以及Fe3+的三元復(fù)合物而呈藍色。當更強的螯合劑將Fe3+從該復(fù)合物中移出，顏色會由藍色轉(zhuǎn)為橘黃色[16]。菌株HB3S-20在CAS培養(yǎng)基上長勢良好，培養(yǎng)3 d后能夠觀察到菌落周圍產(chǎn)生明顯的橘黃色透明暈圈(圖4)，因此，推測菌株HB3S-20在生長過程中能夠分泌出螯合Fe3+的嗜鐵素物質(zhì)。

表3 對峙培養(yǎng)中菌株HB3S-20對V991b菌絲生長的抑制效果

圖4 菌株HB3S-20在CAS上產(chǎn)生的橘黃色透明暈圈

2.6 菌株HB3S-20對棉花發(fā)芽率和棉株生長指標的影響

試驗結(jié)果表明，菌株HB3S-20對棉花的出苗率和植株生長不僅沒有負面作用，還具有一定的促生作用。用HB3S-20菌液浸泡棉花種子14 h后出苗率為74.67%，對照組無菌水處理種子后出苗率為75.50%，說明HB3S-20菌液浸種處理對出苗率的影響很小。菌液處理組棉株生長20 d后根長與對照組相比沒有顯著差異，但株高和鮮質(zhì)量顯著高于對照組(P<0.05)(表4)。

表4 菌株HB3S-20處理棉花種子后的生長指標

3 結(jié)論與討論

本研究通過溫室試驗初篩獲得了1株對棉花黃萎病有防治效果的細菌菌株HB3S-20，多次溫室試驗的結(jié)果表明，其表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的生防效果，平均防效為62.57%。大田試驗也表明，該菌株能夠減輕棉花黃萎病的發(fā)生，防效為54.67%。菌株HB3S-20形態(tài)鑒定的結(jié)果表明，其菌落形態(tài)為淡黃色，不透明，細胞形態(tài)為卵圓狀，屬于革蘭氏陰性菌。用細菌通用引物擴增菌株16S rDNA的部分序列并進行測序和比對分析，推測菌株HB3S-20為惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。

近些年，假單胞菌被認為是一種防治土傳病害的潛在生防菌，具有較為廣闊的應(yīng)用前景[17]。假單胞菌的種類較多，有銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和綠針假單胞菌等，其中報道較多的是熒光假單胞菌[18]。假單胞菌防治植物病害的主要機制有以下3個方面[19]：首先是競爭作用，很多假單胞菌具有極強的根定殖能力，能夠與病原菌形成營養(yǎng)或空間上的競爭關(guān)系；其次是拮抗作用，假單胞菌能夠產(chǎn)生不同種類的拮抗物質(zhì)，如吩嗪類物質(zhì)、間苯三酚、氰化氫等抗生物質(zhì)；另外，某些假單胞菌對植物體具有誘導抗性，能夠誘導植物體產(chǎn)生抗病性。

對峙培養(yǎng)試驗結(jié)果表明，菌株HB3S-20對大麗輪枝菌的生長具有較好的抑制作用。進一步的研究表明，菌株HB3S-20能夠產(chǎn)生嗜鐵素物質(zhì)。嗜鐵素是指由微生物在低鐵條件下合成的能特異螯合Fe3+的一類小分子質(zhì)量的螯合因子。很多假單胞菌能夠產(chǎn)生嗜鐵素[20]，其在植物病害生物防治中的作用已有深入研究。生防菌產(chǎn)生的嗜鐵素主要是通過對Fe3+的競爭影響病原微生物的生長，嗜鐵素能夠絡(luò)合環(huán)境周圍Fe3+，使病原菌得不到足夠的Fe3+營養(yǎng)而不能正常生長繁殖，從而減輕病原菌對植物體的危害，達到控制植物病害的目的[21]。

假單胞菌是活躍在植物根際的一大類植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，能夠通過產(chǎn)生植物激素、ACC脫氨酶、抗生素、嗜鐵素等物質(zhì)調(diào)節(jié)植物的微生態(tài)環(huán)境[22-23]，從而對宿主植物起到防病促生的作用。植物根際促生菌能夠競爭性地定殖在植物的根部，促進植物的生長和減輕病害的發(fā)生。本研究測定了菌株HB3S-20對棉花的促生能力，結(jié)果表明，其對棉花的出苗率和根長無顯著影響，但可以顯著提高棉株的株高和鮮質(zhì)量，說明菌株HB3S-20對棉株具有一定的促生作用。

總體而言，菌株HB3S-20對棉花黃萎病具有較好的生防活性，對大麗輪枝菌具有拮抗作用，能夠產(chǎn)生螯合Fe3+的嗜鐵素類物質(zhì)，并且對棉株具有一定的促生作用。因此，菌株HB3S-20在防治棉花黃萎病方面有較大的應(yīng)用潛力，是一種潛在的生防菌。接下來將繼續(xù)研究菌株HB3S-20防治棉花黃萎病的作用機制，為該生防菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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