，,，，，，，， ，

立克次體目(Rickettsiales)無形體科(Anaplasmataceae)無形體屬(Anaplasmas)立克次體能夠引起人類和動物急慢性傳染病，病原通過吸血節(jié)肢動物叮咬人和動物傳播，野生哺乳動物是無形體的主要宿主。無形體屬中邊緣無形體(A.marginale)、中心無形體(A.centrale)、嗜吞噬細(xì)胞無形體(A.phagocytophilum)、牛無形體(A.bovis)和綿羊無形體(A.ovis)能感染哺乳動物，引起無形體病[1-2]。1932年,嗜吞噬細(xì)胞無形體被確立為動物致病原，1990年美國首次發(fā)現(xiàn)人類病例[3]，之后人發(fā)病率在美國銳增，歐洲國家也發(fā)現(xiàn)了嗜吞噬細(xì)胞無形體感染。1997年以來，已經(jīng)多次證實中國東北部和西北部的蜱、嚙齒動物和家畜中存在嗜吞噬細(xì)胞無形體，包括黑龍江、吉林、新疆以及內(nèi)蒙古[4-7]。2006年安徽省廣德縣發(fā)生一起醫(yī)院感染，一些接觸嗜吞噬細(xì)胞無形體感染患者的醫(yī)護(hù)人員和患者家屬發(fā)病[8]，其它部分省份也有疑似病例發(fā)生[9-10]。在中國北部、南部和西南部已經(jīng)發(fā)現(xiàn)反芻動物中邊緣無形體、中心無形體、血小板無形體(A.platys)、牛無形體和綿羊無形體流行[5,11-13]。2014年，在黑龍江省不明原因發(fā)熱病人血中檢測到與A.centrale相似但不同的新立克次體核酸，并分離到病原體，命名為山羊無形體(A.capra)[14]。2008-2011年，本研究在浙江省部分山區(qū)，采集嚙齒動物肝脾和家畜全血，采用巢式PCR擴(kuò)增無形體屬16S rRNA基因并測序，鑒定嚙齒動物和家畜中存在的無形體種屬，分析其16S rRNA基因變異。

1 材料與方法

1.1調(diào)查地點 調(diào)查點設(shè)在安吉(N30.68、E11968)、天臺(N29.15、E121.03)、金華(N29.12、E119.64)、磐安(N28.84、E120.32)4個縣、市的山區(qū)和丘陵地帶，每個縣、市選擇3個調(diào)查點。調(diào)查時間為2008-2011年。

1.2樣本采集 浙江省蜱活動的高峰季節(jié)是3-4月，另一個較小活動高峰季節(jié)是8-12月。3月和4月采集牛和山羊全血，共53只牛和58只山羊，磐安縣未采集牛羊標(biāo)本。8-12月捕獲452只嚙齒動物，捕獲工具除磐安縣用鼠籠外，其余縣市用鼠夾?，F(xiàn)場進(jìn)行鼠種鑒定，嚙齒動物包括社屬、黑線姬鼠、青毛鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、針毛鼠、小林姬鼠、大林姬鼠、白腹鼠、黑線倉鼠和松鼠。從嚙齒動物中無菌解剖取肝和脾(0.5～1)cm×1.5 cm小塊。標(biāo)本在液氮保存，運送至浙江省疾病預(yù)防控制中心待用。

1.3DNA提取 約100 mg脾和肝切成小塊，研磨成勻漿，或200 μL血液用于提取DNA，采用Universal Genomic DNA extraction Kit(Takara生物技術(shù)有限公司，大連)，根據(jù)說明書進(jìn)行。

1.416S rRNA基因PCR擴(kuò)增和測序 篩選試驗：參照《人粒細(xì)胞無形體病預(yù)防控制技術(shù)指南》實驗室檢測方案進(jìn)行靶向無形體16S rRNA基因389 bp較恒定區(qū)序列的巢式PCR，引物見表1(上海生工生物技術(shù)有限公司合成)，篩選無形體屬各種群陽性樣本。

鑒定試驗：篩選試驗中陽性的樣本通過另一巢式PCR進(jìn)一步擴(kuò)增接近完整16S rRNA基因的核苷酸序列，第1輪引物Out1和EC9，第2輪引物EC12A和Out2擴(kuò)增約643 bp的片段，OBPf603/MCf603和Ar1451擴(kuò)增789 bp的片段。取20 μLDNA作為第1輪PCR的模板，10 μL第1輪擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物作為第2輪反應(yīng)的模板，均為50 μL反應(yīng)體系。擴(kuò)增程序：第1輪，94 ℃ 5 min急變性， 94 ℃ 3 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，40個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min延伸。第二輪擴(kuò)增程序除延伸時間改為40 s外，基本同第一輪。目標(biāo)條帶用3730DNA Analzer測序儀測序(上海生工生物技術(shù)有限公司)。樣本TT-025中用引物EC12A和Out2得到的PCR產(chǎn)物，通過pUCm-T載體(生工生物技術(shù)有限公司，上海)克隆測序。643 bp和789 bp的序列通過Mega 5.0軟件比對拼接成1 400 bp左右的片段。

表1 16S rRNA引物和序列

Tab.1 16S rRNA primers

引物名序列(5'-3')產(chǎn)物/bp參考文獻(xiàn)Out1ttgagagtttgatcctggct-cagaacg652[15]Out2cacctctacactaggaattc-cgctHGA1gtcgaacggattattctttat-agcttg389[9]HGA2tataggtaccgtcattatct-tccctacEC12Atgatcctggct-cagaacgaacg1458[2]EC9taccttgttacgacttMCOf603ctgcttttaatactgcag-gacta789本研究PPBf603ctgcttttaatactgccagact789本研究Ar1451cccaaccttaaatggctgcc本研究

1.5序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析 目標(biāo)條帶測序獲得的核苷酸序列進(jìn)行Blast比對(http:www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST)，并通過Mega 5.0軟件與GenBank中登錄的其它無形體序列進(jìn)行多序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析[16]，進(jìn)化歷史推斷采用Neighbor-Joining方法，Bootstrap試驗采用1 000次重復(fù)，進(jìn)化距離采用p-distance方法計算。

1.6核苷酸序列GenBank登錄號 本文引用的無形體16S rRNA參考序列的GenBank登錄號及菌株名稱在圖1和圖2注明。本文測序獲得新的無形體序列GenBank登錄號：HM439430、HM439432、HM439433、EU595732、JN862824、JN862825、KM817188。

2 結(jié) 果

2.1各無形體種感染率 篩選試驗檢測安吉、天臺、金華牛和山羊血液樣本，陽性率分別為27.3%(9/33)、97.7%(42/44)、20.6%(7/34)，結(jié)果見表2。無形體16S rRNA目標(biāo)片段(389 bp)的陽性率分別為58.5% (31/53) 和43.1% (25/58)。452只嚙齒動物的肝脾樣本中，22個樣本被擴(kuò)增到389 bpDNA片段，四縣、市所調(diào)查鼠無形體的感染狀況見表3。感染鼠種包括社屬、黑線姬鼠、青毛鼠、黃毛鼠、黃胸鼠、褐家鼠、白腹鼠、黑線倉鼠和松鼠，而針毛鼠、小林姬鼠和大林姬鼠沒有檢測到陽性。每次實驗的陰性對照未檢測到目標(biāo)片段。當(dāng)?shù)仫曫B(yǎng)牛羊較少(已經(jīng)將調(diào)查點所有牛羊納入調(diào)查)，天臺的13只羊來自同一農(nóng)戶，安吉山羊中也有10只來自同一農(nóng)戶。另外，隨機(jī)捕獲到各種嚙齒動物量不均衡，因此沒有采用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行感染率比較。

表2 家畜無形體感染率

Tab.2 Incidence of Anaplasma infection in domestic animals

調(diào)查點感染率%(感染數(shù)/總數(shù))牛山羊總計安吉16.7(1/6)18.5(8/27)27.3(9/33)天臺100.0(31/31)84.6(11/13)97.7(42/44)金華12.5(2/16)27.8(5/18)20.6(7/34)

表3 嚙齒動物無形體感染率

Tab.3 Incidence of Anaplasma infection in rodent animals

調(diào)查點感染數(shù)/總數(shù)R.cA.aB.bR.lR.tR.nN.fA.sA.pN.cCricetulussquirrelTotal(%)安吉4/271/341/34?1/17/96(8.3)天臺1/81/140/20/2?2/26(7.7)金華5/470/11/170/10/5?1/297/100(7.0)磐安0/270/31/141/321/191/310/380/30/82/52?0/36/230(2.6)

R. c，社鼠；A. a，黑線姬鼠；B. b，青毛鼠；R. l, 黃毛鼠；R. t，黃胸鼠；R. n, 褐家鼠；N.f，針毛鼠；A. s，小林姬鼠；A. p，大林姬鼠；N. c，白腹巨鼠。

2.2無形體基因鑒定與系統(tǒng)發(fā)生分析 78份篩選試驗陽性的389 bp片段測序，獲得16S rRNA基因約350 bp的核苷酸序列，多序列比對和系統(tǒng)發(fā)生分析表明分別與6個無形體種相似(表4，圖1)。篩選試驗中陽性的樣本進(jìn)一步擴(kuò)增接近完整16S rRNA基因的核苷酸序列，通過測序和剪切，23份標(biāo)本獲得1 397-1 424 bp的16S rRNA序列，1份樣本只測到641 bp序列。多序列比對顯示7個序列型(表5)，代表序列分別命名為ZJ01/2008, ZJ06/2009, ZJ01/2009, ZJ02/2009, ZJ04/2009，ZJ05/2009和ZJ07/2009。初步分析表明，各縣市無形體種感染狀況差異較大(表5)，天臺地區(qū)動物尤其是牛的無形體種多樣性尤為顯著。

6個樣本檢測到389 bp序列與A.phagocytophilum相似，鑒定試驗僅1樣本(黃毛鼠)再次擴(kuò)增到643 bp和789 bp片段，拼接獲得1 420 bp序列ZJ01/2008(HM439430)。1 420 bp序列比對分析與褐家鼠分離的河南菌株HN(KC470064)僅1 bp差異[17]，與另外3個浙江嗜吞噬細(xì)胞無形體序列(DQ458805、DQ458807、DQ458808)有99. 8%的相似性[18]，后3個序列分別在褐家鼠、社鼠、白腹鼠中檢測到，而與原型株Webster有99.2%的相似性。引物EC12A和Out2擴(kuò)增樣本TT-025的PCR產(chǎn)物，因為16S rRNA基因序列上游區(qū)域雙峰反復(fù)測序沒有成功。最后，通過pUCm-T載體克隆測序，挑選了23個菌斑測序，結(jié)果顯示在31 bp上游區(qū)域顯示明顯差異，其中8個菌斑序列一致，即ZJ06/2009(JN86825)，與序列ZJ01/2008和菌株

表4 無形體屬各個種在動物中的感染狀況

Tab.4 Infection status of Anaplasma species in animals

動物種屬陽性樣本數(shù)A.phagocytophilumA.capraA.marginaleA.bovisA.platysA.spp.aA.spp.b感染數(shù)(%)牛5116830334/53(64.15)山羊0312100025/58(43.1)社鼠00020709/101(8.9)黑線姬鼠10000102/46(4.4)青毛鼠00010102/48(4.2)黃毛鼠10020003/63(4.8)黃胸鼠00000101/19(5.3)褐家鼠00000101/33(3.3)針毛鼠00000000/41(0)小林姬鼠00000000/8(0)大林姬鼠00000000/8(0)白腹巨鼠10000102/52(3.9)黑線倉鼠00010001/29(3.5)松鼠10000001/4(25.0)

a在鼠中發(fā)現(xiàn)的未分類無形體；b在牛中發(fā)現(xiàn)的未分類無形體。

表5 無形體屬各個種的地區(qū)分布

Tab.5 Regional distribution of Anaplasma species

無形體種天臺安吉金華磐文牛山羊鼠牛山羊鼠牛山羊鼠鼠A.phagocytophilum4020011001A.capra10201000100A.marginale6000000100A.bovis7900821431A.platys3000000000Anaplasmaspp.a0000040044Anaplasmaspp.b3000000000

Webster相似性均為99.1%，另7個菌斑序列與A. marginale完全一致，表明TT-o25存在混合感染。另有3個牛血樣本389 bp序列(TT-020、TT-023和TT-031)與浙江山羊檢測到序列ZJ81(KP062963)100%一致。見表6。

389 bp序列與A.bovis相似的33個樣本，包括山羊、牛、社鼠、黃毛鼠和黑線倉鼠，其中4個樣本鑒定試驗中完成大約1 400 bp的序列測序。多序列比對，4個序列有1個或2個互相不同的SNP，ZJ04/2009代表共同一致的序列(1412 bp)提交到GenBank(HM595732)。序列ZJ04/2009、Wulong(FJ169956)、wlg-2(FJ389577)和zxg-1(FJ389573)有99.72%～99.86%的相似性，后3個序列在中國西南部山羊中檢測到[11]，序列ZJ04/2009與A.bovis原型株U03735有99.43%的相似性。

表6 16S rRNA基因的核苷酸序列比對分析

Tab.6 Alignment analysis for nucleotide sequences of 16s rRNA gene

序列型(樣本數(shù)*)登錄號(大小/bp)無形體種參考序列相似性(%)總陽性數(shù)**ZJ01/2008(1)HM439430(1424)A.phagocytophilumWebsterHN99.299.99***ZJ06/2009(1)JN862825(1434)A.phagocytophilumWebsterZJ01/200899.199.1ZJ04/2009(4)HM595732(1412)A.bovisLdenbergWulong99.499.934表6(續(xù))序列型(樣本數(shù)*)登錄號(大小/bp)無形體種參考序列相似性(%)總陽性數(shù)**ZJ01/2009(4)HM439432(1409)A.centraleAomoriRongchang10099.915ZJ02/2009(5)HM439433(1410)A.marginaleF12Lushi1001009ZJ07/2009(1)KM817188(641)A.platysOkinawaBomPastor99.71003ZJ05/2009(8)JN862824(1416)Anaplasmaspp.aLdenbergZJ04/200998.898.612

*完成大約1 400 bp測序的樣本數(shù)；**389 bp序列相似的總樣本數(shù)；***A.phagocytophilum相關(guān)序列，389 bp序列未能分類，ZJ01/2008(1)和ZJ06/2009(1)總陽數(shù)為9。

圖1 16S rRNA基因350 bp核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.1 Phylogenetic tree of the 16S RNA gene based on 350 bp nucleotide sequences

389 bp序列與A.capra相似的14個樣本(來自山羊、牛)，鑒定試驗中4樣本獲得1 409 bp序列(ZJ01/2009，HM439432)，與日本菌株Aomori有100%的相似性，與中國西南部檢測到的3個序列Rongchang(EU709493)、szg-1(FJ389574)和szg-3(FJ389576)之間有99.86%～99.93%的相似性。9個樣本(牛和山羊)檢測到389 bp序列與A.marginale相似，其中5個樣本獲得1 410 bp序列(ZJ02/2009，HM439433)，與澳大利亞菌株F12以及在中國中部牛中檢測到的序列(HM538192)有100%的相似性。另外，在天臺縣的牛中檢測到389 bp序列與A.platys相似的3個樣本，僅1樣本擴(kuò)增到643 bp片段 (ZJ07/2009，KM817188)。

值得注意的是，序列ZJ05/2009廣泛存在于野生鼠中，包括社鼠、青毛鼠、黑線倉鼠、黃胸鼠、褐家鼠和白腹巨鼠。除了天臺縣，進(jìn)行調(diào)查的其它縣市野鼠都有檢測到。650 bp片段在5個樣本中測序成功，790 bp片段在3個樣本中測序成功，這些序列100%一致。序列ZJ05/2009(1416 bp)與菌株U03775有98.80%的相似與序列ZJ04/2009有98.52%的相似，與GenBank中的其它無形體序列明顯不同。

系統(tǒng)發(fā)生分析表明(圖2)，浙江省嚙齒動物、牛和山羊中檢測到的16S rRNA基因序列分布在6個主要的無形體種群中，包括嗜吞噬細(xì)胞無形體、牛無形體、邊緣無形體、山羊無形體、血小板無形體和一種新發(fā)現(xiàn)的變異株ZJ05/2009。

圖2 16S rRNA基因1 356 bp核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S RNA gene based on 1 356 bp nucleotide sequences

3 討 論

野生哺乳動物是無形體屬立克次體感染的主要宿主，關(guān)于嗜吞噬細(xì)胞無形體宿主譜的研究較多，其野生動物宿主包括野豬、歐洲刺猬、棕熊、鹿、兔、馬、牛、羊、狗和嚙齒動物[19]。調(diào)查表明中國北部、中部和西南部的牛和羊中存在嗜吞噬細(xì)胞無形體和其它無形體屬立克次體感染[5,11-13]，浙江省檢測到嗜吞噬細(xì)胞無形體的感染的動物除了家畜，還有包括松鼠的嚙齒動物[18,20]。本研究通過對16S rRNA基因的測序鑒定無形體種屬，浙江牛和羊存在A.phagocytophilum、A.bovis、A.marginale和A.platys，另一個研究表明浙江麗水山區(qū)山羊存在A.ovis感染[12]，因此浙江家畜中存在除A.centrale以外的所有已被認(rèn)識的無形體種。而嚙齒動物除了存在A.phagocytophilum感染外，社鼠、黃毛鼠和青毛鼠中還存在A.bovis感染。據(jù)我們所知，這是嚙齒動物A.bovis感染的首次報道。

1966年日本于感染牛中首次分離無形體Aomori株，分類學(xué)地位曾歸屬于A.centrale種[21]。2010年，我們在浙江省牛和山羊血中檢測到與Aomori株100%一致的16S rRNA基因序列(ZJ01/2009，HM439432)，本研究3只山羊和11只牛血檢測到相同序列，在中國西南部的牛中也曾檢測到3個相似序列(99.86%～99.93%)Rongchang(EU709493)、szg-1(FJ389574)和szg-3(FJ389576)[11]。直到2014年，黑龍江省不明原因發(fā)熱病人血中分離到病原體，最終被定位為無形體屬的一個新種A.capra[14]。

16S rRNA基因常被用以細(xì)菌鑒定或種屬分類，認(rèn)為16S rRNA基因序列的相似性至少達(dá)到95%才能確定一個屬，至少達(dá)到99%才能確定一個種[22]。一個流行株ZJ05/2009廣泛存在于野鼠中，但家畜中沒有發(fā)現(xiàn)。ZJ05/2009株與A.bovis的16S rRNA基因序列的相似性低于98.8%，推測可能為嚙齒動物中一種與A.bovis相關(guān)的無形體新種。2006年以來，我們曾在浙江黃毛鼠和社鼠中檢測到與菌株ZJ05/2009相同的序列(EF535107和FJ182047)[23]，其16S rRNA基因序列沒有變異，推測它可能是浙江省嚙齒動物中長期存在一個流行株，是否會導(dǎo)致人類和動物疾病還不清楚，需要進(jìn)一步關(guān)注。

浙江省家畜和嚙齒動物流行的5個已認(rèn)識無形體種中，A.phagocytophilum的16S rRNA基因變異相當(dāng)大。至今為止，至少檢測到4種不同的嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因代表序列(ZJ-HGA-1、ZJ01/2008、ZJ06/2009和ZJ81)，明顯不同于中國東北部以及世界其它地區(qū)的嗜吞噬細(xì)胞無形體菌株?；?6S rRNA、gltA、msp4和groESL基因序列分析，有學(xué)者認(rèn)為菌株ZJ-HGA-1可能是一種新的嗜吞噬細(xì)胞無形體變異株[18]。因為立克次體核酸比較容易降解，多基因、大信息量的新種鑒定研究需要分離到病原體才可能實現(xiàn)，必須加大力度投入分離病原體的工作。值得關(guān)注的是，在浙江省甚至整個中國發(fā)現(xiàn)人粒細(xì)胞無形體病病例很少，浙江省迄今只有1例人粒細(xì)胞無形體病確診[24]，原因可能是該疾病還未被臨床醫(yī)生充分認(rèn)識而漏診，我們有必要進(jìn)一步關(guān)注無形體屬立克次體人感染的早期診斷。另外是否因為變異導(dǎo)致毒力下降，使之臨床癥狀不明顯抑或不致病。在浙江省動物的無形體屬中存在潛在的變異和新種，我們還不清楚基因多樣性是否會導(dǎo)致發(fā)病率、致病性或臨床特征上的一些變化。

(致謝: 現(xiàn)場樣本采集得到浙江省安吉縣疾病預(yù)防控制中心、金華金東區(qū)疾病預(yù)防控制中心、天臺縣疾病預(yù)防控制中心、磐安縣疾病預(yù)防控制中心同行大力支持與協(xié)助，一并致謝。)

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