hMTERF3基因在卵巢癌組織的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響＊

熊 偉，楊勇琴，李 彬，梅 雯，嚴(yán)長寶，戴莉萍，余 敏

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而居第三位，但卵巢癌病死率居各類婦科惡性腫瘤的首位，5年生存率不足30%，嚴(yán)重威脅女性健康和生命［1］。卵巢癌早期癥狀隱匿，常在癥狀出現(xiàn)之前已經(jīng)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于晚期［1］。卵巢癌的臨床治療以手術(shù)為主，化療為輔，并配合放療、生物學(xué)治療等手段［2］。近年來，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，卵巢癌的基因治療成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)，并在臨床上取得了較好的療效，具有較好的應(yīng)用前景。

人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子3（human mitochondrial transcription termination factor 3，hMTERF3），也稱為線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域1（human mitochondrial transcription termination factor domain containing 1，hMTERFD1），是由417個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)［3］。在人、大鼠、小鼠等7個(gè)不同的物種中進(jìn)行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)包含5個(gè)保守的MTERF基序，含有3個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，是MTERF蛋白家族進(jìn)化最保守的成員［4］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，敲除MTERF3基因的小鼠線粒體DNA拷貝數(shù)上升，MTERF3通過結(jié)合線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）啟動(dòng)子區(qū)而抑制線粒體基因表達(dá)過程，缺失MTERF3的細(xì)胞線粒體DNA兩條鏈的轉(zhuǎn)錄起始活性均有增加，證明核基因編碼的MTERF3是一種轉(zhuǎn)錄負(fù)性調(diào)控因子［5］。 Park 等［5］研究表明，哺乳動(dòng)物MTERF3顯著抑制mtDNA的表達(dá)，通過減少呼吸鏈復(fù)合體蛋白亞基的產(chǎn)生而降低氧化磷酸化水平，從而減少細(xì)胞內(nèi) ATP 的合成［5，6］。但目前為止，關(guān)于hMTERF3在卵巢癌中研究的尚未見報(bào)道。

利用基因芯片或者轉(zhuǎn)錄組分析為代表的高通量測序技術(shù)目前已經(jīng)成為惡性腫瘤研究的強(qiáng)大工具，然而由于測序平臺(tái)、樣本數(shù)量以及分析方法的不同，常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差，結(jié)果分析比較片面。如何有效利用上述資源是當(dāng)前科研人員面臨的重大問題。數(shù)據(jù)挖掘及整合分析可以聯(lián)合運(yùn)用多種數(shù)據(jù)消除以上因素的影響，從整體的角度來理解這些數(shù)據(jù)。目前，生物數(shù)據(jù)整合分析逐漸成為大數(shù)據(jù)挖掘的重要方向，并已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種類型的惡性腫瘤分析中。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是大型的腫瘤基因芯片整合數(shù)據(jù)庫，最新數(shù)據(jù)涵蓋已知所有的癌癥類型，包含715個(gè)數(shù)據(jù)集，共計(jì)86 733個(gè)癌組織及正常組織數(shù)據(jù)。利用Oncomine可以進(jìn)行腫瘤組織及其相應(yīng)的正常組織中的mRNA表達(dá)差異分析，可以尋找潛在感興趣的基因，其整合的大量數(shù)據(jù)保證分析結(jié)果具有極其重要的參考價(jià)值，也可以發(fā)現(xiàn)潛在的腫瘤生物標(biāo)志物和腫瘤基因治療靶點(diǎn)。該研究擬通過對(duì)Oncomine基因芯片和臨床實(shí)驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)的整合分析，比較分析hMTERF3基因在正常卵巢上皮組織與卵巢癌組織中表達(dá)水平，并探討其表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中挖掘數(shù)據(jù)Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫是一個(gè)基于基因芯片研究的數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)，在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)研究的需要進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選和挖掘的條件設(shè)定。該研究中，筆者設(shè)定的數(shù)據(jù)篩選條件為：（1）“Gene：MTERFD1”；（2） “Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”；（3）“Cancer Type：Ovarian Cancer”；（4）“Date Type：mRNA”；（5）“Simple Type：Clinical Specimen”；（6）臨界值設(shè)定條件 （P value＜1×10-4，fold change=2，gene rank=top 10%）。數(shù)據(jù)輸出另存為Excel表格。

1.2 Western blot檢測hMTERF3蛋白在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達(dá)選取2016年—2017年大理白族自治州第一人民醫(yī)院病理科收集的30例卵巢癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常卵巢上皮組織，提取30對(duì)配對(duì)卵巢癌和正常卵巢上皮組織總蛋白，采用BCA法測定各組樣本蛋白質(zhì)的濃度。各取50 μg蛋白質(zhì)上樣，用SDS-PAGE凝膠電泳儀系統(tǒng)電泳分離總蛋白質(zhì)，采用Trans-BlotTurboTM將蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)?。?5 V，7 min）至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h，加入兔抗人MTERFD1多克隆抗體 （1∶1000稀釋）4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，同時(shí)檢測GAPDH蛋白的表達(dá)水平作為內(nèi)參照；TBST液洗滌3次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗 （1∶5000稀釋）4℃孵育2 h，TBST洗滌3次，5 min/次。將超敏型ECL顯影液滴于PVDF膜條上，用ChemiDocTMXRS+超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色曝光，掃描成圖像。蛋白質(zhì)條帶用Image LabTM5.2.1軟件進(jìn)行灰度值的計(jì)算，以MTERF3/GAPDH的比值表示MTERF3蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3 Kaplan-Meier Plotter進(jìn)行患者生存周期分析利用 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis/）的卵巢癌數(shù)據(jù)集對(duì)hMTERFD1進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的Kaplan-Meier生存曲線、風(fēng)險(xiǎn)比（Hazard ratio，HR）及 Log rank P（P value）值。探針選擇為 JetSet，所需的有效Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1）。首先根據(jù)人MTERFD1 mRNA表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，截尾數(shù)據(jù)為腫瘤無進(jìn)展生存期 （progression free survival，PFS）。符合條件的總病例數(shù)為1436例，分析人MTERFD1表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。然后，設(shè)定截尾數(shù)據(jù)為總體生存期 （overall survival，OS），符合條件總病例數(shù)為1657例，分析人MTERFD1表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系。篩選條件如下：（1）“Cancer type：Ovarian Cancer”；（2）“Gene：MTERFD1”；（3）“Survival：OS or PFS”。

1.4 hMTERF3在不同分期卵巢癌中的預(yù)后作用

分別設(shè)截尾數(shù)據(jù)為PFS和OS，然后探針選擇為JetSet， 所 需 的 有 效 Affymetrix ID：219363_s_at（MTERFD1），在Stage選項(xiàng)下面分別選擇1期、1+2期、2期、2+3期、2+3+4期、3期、3+4期、4期， 分別在線分析人MTERFD1在不同腫瘤分期的卵巢癌患者中的預(yù)后作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正常對(duì)照組和卵巢癌患者病例組之間hMTERF3表達(dá)的差異采用t檢驗(yàn)。所用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行，以雙側(cè)P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 hMTERF3在所有腫瘤類型中的表達(dá)Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫中共收集了756個(gè)不同類型的研究結(jié)果，其中關(guān)于hMTERF3表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的研究結(jié)果共104個(gè)，hMTERF3表達(dá)增高的研究有76個(gè)，hMTERF3表達(dá)降低的研究有28個(gè) （表1）。在婦科常見的惡性腫瘤中，乳腺癌中高表達(dá)的研究有12個(gè)，低表達(dá)的有5個(gè)；子宮頸癌中高表達(dá)的研究有2個(gè)，低表達(dá)的研究有0個(gè)；卵巢癌中高表達(dá)的研究有1個(gè)，低表達(dá)的研究有2個(gè)。

2.2 hMTERF3在卵巢癌中的表達(dá)在Oncomine v4.5數(shù)據(jù)庫中，從2004年開始至今，共有11項(xiàng)研究涉及hMTERF3在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)，共包括995個(gè)樣本（圖1）。文章分別發(fā)表 于 Cancer Research［7，8］、Clinic Cancer Research［9］及 Cancer Science［10］。 薈萃 11 個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，hMTERF3在卵巢癌中高表達(dá)，其中位數(shù)值為3781.0，P=0.020，表明其高表達(dá)具有顯著性差異。

表1 hMTERF3在Oncomine數(shù)據(jù)庫中所有人類腫瘤相關(guān)研究中的表達(dá)

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因在卵巢癌中的表達(dá)

2.3 在不同研究中卵巢癌組織與正常卵巢組織hMTERF3的表達(dá)差異在Oncomine數(shù)據(jù)庫中，筆者獲取4個(gè)不同研究的基因芯片數(shù)據(jù)，作箱圖比較分析，在所有研究的結(jié)果中，與正常卵巢組織相比，hMTERF3 mRNA在卵巢癌中的表達(dá)量均顯著增高（P＜0.05）（圖 2）。

2.4 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織hMTERF3蛋白的表達(dá)通過Western blot檢測30例配對(duì)卵巢癌與正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，28例 （93.33%）卵巢癌組織中hMTERF3蛋白表達(dá)水平較正常卵巢上皮組織顯著增高 （P＜0.05），而在2例卵巢癌組織中hMTERF3蛋白表達(dá)水平增高不顯著（P＞0.05）（圖 3）。

2.5 hMTERF3表達(dá)量與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系為進(jìn)一步明確hMTERF3基因表達(dá)量與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系，通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生存分析、風(fēng)險(xiǎn)比和Log-Rank檢驗(yàn)。當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者PFS，經(jīng)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，HR=1.21，log-rank P 值為0.0027。當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者OS，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線分析，得到了相似的結(jié)果，HR=1.22，log-rank P值為0.0028。以上結(jié)果提示，hMTERF3 mRNA的表達(dá)水平是卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（HR＞1），其表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差（圖 4）。

2.6 各個(gè)分期卵巢癌患者的預(yù)后與hMTERF3 mRNA水平的關(guān)系截尾數(shù)據(jù)為PFS時(shí)，早期卵巢癌患者（1期、1+2期或2期）中hMTERF3表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差（HR＞1）。其中在1+2期卵巢癌患者中HR值為2.43，表明越早期的卵巢癌患者，hMTERF3表達(dá)水平的預(yù)后價(jià)值越大。將截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS，得出了相似的結(jié)果（表2）。認(rèn)為早期卵巢癌患者中hMTERF3 mRNA水平越高，患者預(yù)后的越差。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中hMTERF3基因在不同卵巢癌研究芯片中的表達(dá)

圖3 卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織的hMTERF3蛋白的表達(dá)（＊P＜0.05）

圖4 hMTERF3表達(dá)量與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

卵巢癌發(fā)病的病因目前并不明確，可能與外部因素（包括物理、化學(xué)、生物致癌因子）和內(nèi)部因素（包括免疫功能、內(nèi)分泌、遺傳、精神等因素），以及飲食營養(yǎng)失調(diào)和不良生活習(xí)慣等相關(guān)［11-13］。MTERF3是MTERF蛋白家族進(jìn)化最保守的成員，基因敲除MTERF3的純合子小鼠將導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常和死亡［14，15］。體外凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）和體內(nèi)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn) （ChIP）證實(shí)，哺乳動(dòng)物MTERF3能與線粒體重鏈轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合，缺失MTERF3將導(dǎo)致線粒體DNA轉(zhuǎn)錄起始水平的增加，則進(jìn)一步證實(shí)哺乳動(dòng)物MTERF3是一種線粒體基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控因子［5］。Wrdenberg等報(bào)道，MTERF3蛋白還能調(diào)節(jié)線粒體中核蛋白體大亞基的組裝，影響核蛋白體的生物合成，導(dǎo)致氧化磷酸化水平降低，細(xì)胞內(nèi)能量合成減少［16］。Oncomine是一個(gè)大型的腫瘤基因芯片分析整合數(shù)據(jù)庫，為廣大的科研工作者提供公開、免費(fèi)的整合分析資源，數(shù)據(jù)來源為公開發(fā)表的各種高通量基因測序數(shù)據(jù)。Oncomine平臺(tái)為不熟悉高通量分析的科研工作者提供了一個(gè)便捷的方式獲取整合信息，只需要輸入基因名稱即可得到該基因在各種類型腫瘤中的mRNA表達(dá)水平差異等分析結(jié)果，并且以直觀的形式輸出［17］。通過對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)庫的整合分析，筆者發(fā)現(xiàn)hMTERF3在卵巢癌組織中顯著高表達(dá)。目前研究報(bào)道，hMTERF3基因在肺癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中高表達(dá)［18］，但是該基因在卵巢癌中的研究相對(duì)較少。筆者對(duì)hMTERF3基因在Oncomine數(shù)據(jù)庫中表達(dá)情況分析，發(fā)現(xiàn)該基因在大部分腫瘤類型中均呈現(xiàn)高表達(dá)（表1），這一結(jié)果也證實(shí)了已有的報(bào)道。該研究還采用Western blot技術(shù)對(duì)30例卵巢癌組織及其配對(duì)的正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析，檢測發(fā)現(xiàn)28例（93.33%）卵巢癌組織中hMTERF3蛋白比正常卵巢上皮組織中呈顯著的高表達(dá)（P＜0.05），使結(jié)果得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。該研究的不足之處為樣本數(shù)量有限，亟待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

表2 各個(gè)分期卵巢癌患者的預(yù)后與hMTERF3 mRNA水平的關(guān)系

Kaplan Meier Plotter是目前世界上被廣泛接受的一個(gè)預(yù)后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，總計(jì)涵蓋了10 461例腫瘤樣本，其中包括5143例乳腺癌樣本、1816例卵巢癌樣本、2437例肺癌樣本和1065例胃癌樣本，可以對(duì)54 675個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)預(yù)后分析，并得出真實(shí)可信的客觀結(jié)果［19，20］。該文首次通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了hMTERF3基因表達(dá)水平在卵巢癌患者及不同分期卵巢癌患者中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示，卵巢癌臨床分期未明時(shí)，hMTERF3表達(dá)量越高，卵巢癌的預(yù)后越差，是一個(gè)理想的預(yù)測卵巢癌預(yù)后的分子標(biāo)記；在1期、1+2期及2期卵巢癌中，當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為PFS時(shí)，HR值均大于1。其中1+2期卵巢癌HR值為2.43，log rank P＜0.01；該期截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS時(shí)，HR值1.75，log rank P=0.1698?？紤]到 OS 為總生存率患者死亡原因多樣（存在非腫瘤致死），且P值較小，推測hMTERF3可很好地預(yù)測早期卵巢癌患者預(yù)后；當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS時(shí)，在1期，1+2期，2期，2+3期，2+3+4期，3期，3+4期及4期卵巢癌患者中HR值均大于1，說明hMTERF3表達(dá)水平對(duì)早、中、晚期卵巢癌患者均具有很好的預(yù)后價(jià)值。

總之，該研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對(duì)腫瘤相關(guān)基因的信息進(jìn)行深入挖掘，提出hMTERF3在卵巢癌組織中高表達(dá)；通過Western blot對(duì)卵巢癌及其配對(duì)的正常卵巢上皮組織中hMTERF3蛋白水平進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)證實(shí)hMTERF3在卵巢癌組織中高表達(dá)；進(jìn)一步分析hMTERF3表達(dá)對(duì)卵巢癌患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)hMTERF3高表達(dá)與卵巢癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，將為進(jìn)一步探討hMTERF3在卵巢癌發(fā)生中的作用提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行惡性腫瘤及其對(duì)應(yīng)正常組織的基因表達(dá)差異分析，對(duì)普通科研工作者整合分析大量腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)，尋找潛在的感興趣的腫瘤相關(guān)基因具有參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

［1］SIEGEL RL，MILLER KD，JEMAL A.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

［2］ZHOU J，HUANG XH.Review of the treatment of ovarian cancer［J］.Modern Oncology，2012，20（6）：1308-1311.

［3］ROBERTI M，POLOSA P L，BRUNI F，et al.The MTERF family proteins：mitochondrial transcription regulators and beyond［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1787（5）：303-311.

［4］XIONG W，YU M，ZUO SY.Regulatory roles of mitochondrial transcription termination factor（MTERF） family proteins in mitochondrial gene expression［J］.Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2015，31（3）：223-231.

［5］PARK CB，ASIN-CAYUELA J，CAMARA Y，et al.MTERF3 is a negative regulator of mammalian mtDNA transcription ［J］.Cell，2007，130（2）：273-285.

［6］ANDERSSON DC，F(xiàn)AUCONNIER J，PARK CB.Enhanced cardiomyocyte Ca（2+） cycling precedes terminal AV-block in mitochondrial cardiomyopathy Mterf3 KO mice［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15（9）：2455-2464.

［7］BONOME T，LEVINE DA，RANDONOVICH M，et al.A gene signature predicting for survival in subopimally debulked patients with ovarian cancer［J］.Cancer Res，2008，68（13）：5478-5486.

［8］HENDRIX ND，WU R，KUICK R，et al.Fibroblast growth factor 9 has oncogenic activity and is a downstream target of Wnt signaling in ovarian endometrioid adenocarcinomas［J］.Cancer Res，2006，66（3）：1354-1362.

［9］LU KH，PATTERSON AP，WANG L，et al.Selection of potential markers for epithelial ovarian cancer with gene expression arrays and recursive descent partition analysis［J］.Clin Cancer Res，2004，10（10）：3291-3300.

［10］YOSHIHARA K，TAJIMA A，KOMATA D，et al.Gene expression profiling of advanced-stage serous ovarian cancers distinguishes novel subclasses and implicates ZEB2 in tumor progression and prognosis［J］.Cancer Sci，2009，100（8）：1421-1428.

［11］JI XN，F(xiàn)ENG YJ.Progress in study of etiology of ovarian epithelial cancer［J］.China Oncology，2014，24（11）：861-864.

［12］LIAO XY.Risk factors of epithelial ovarian cancer recurrence［J］.Modern Oncology，2016，24（14）：2283-2285.

［13］ZHAO XC，HUANG HB.The immunological etiology research progress of ovarian cancer［J］.Chinese Journal of Immunology，2014，30（6）：862-865.

［14］ROBERTI M，BRUNI F，LOGUERCIO-POLOSA P，et al.MTERF3，the most conserved member of the mTERF-family，is a modular factor involved in mitochondrial protein synthesis［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1757（9/10）：1199-1206.

［15］SPAHR H，SAMUELSSON T，HALLBERG BM，et al.Structure of mitochondrial transcription termination factor 3 reveals a novel nucleic acidbinding domain［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，397（3）：386-390.

［16］WRDENBERG A，LAGOUGE M，BRATIC A，et al.MTERF3 regulates mitochondrial ribosome biogenesis in invertebrates and mammals［J］.PLoS Genet，2013，9（1）：e1003178.

［17］LI L，XIONG GP，YAN L，et al.Expression and significance of CCNB1 in ovarian cancer［J］.Current Advances in Obstetrics and Gynecology，2016，25（11）：818-820.

［18］ZHANG C，WU N，GAO F，et al.MTERFD1 functions as an oncogene［J］.Oncotarget，2016，8（38）：1-10.

［19］SZASZ AM，LANCZKY A，NAGY A，et al.Cross-validation of survival associated biomarkers in gastric cancer using transcriptomic data of 1065 patients［J］.Oncotarget，2016，7（31）：49322-49333.

［20］OCANA A，PEREZ-PENA J，ALCARAZ-SANABRIA A，et al.In silico analyses identify gene-sets，associated with clinical outcome in ovarian cancer：role of mitotic kinases［J］.Oncotarget，2016，7（16）：22865-22872.