宋云林,譚秋嬋,馬燕,白林林,柴瑞峰,王毅,于湘友
血管內(nèi)皮祖細胞(EPC)是干細胞移植治療缺血性疾病的重要種子細胞,目前基礎(chǔ)研究已有一定進展,但長期療效值得商榷,其中EPC復制性衰老可能是影響其長期療效的重要因素。p53可誘導細胞周期阻滯引起衰老或凋亡;沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)參與了多種重要的抗衰老基因的調(diào)控,能使p53蛋白活性下降;微小核糖核酸(miR)-34a能抑制SIRT1及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白等的基因表達,進而加速細胞衰老;故推測p53-miR-34a-SIRT1反饋環(huán)在細胞衰老過程中起著重要作用[1]。同時,活化后的p53也能增加miR-34a的表達,進一步強化對細胞凋亡的調(diào)控作用。另一方面,miR-34a通過抑制SIRT1的產(chǎn)生,從而促進p53的活化[2,3]。故由此推測p53-miR-34a-SIRT1形成的正反饋環(huán)在細胞凋亡和增殖的過程中扮演者重要的角色。本研究的目的為明確p53-miR-34a-SIRT1在EPC復制性衰老過程中的反饋調(diào)節(jié)機制,評估m(xù)iR-34a抑制因子能否成為延緩EPC衰老的靶點,為提高EPC治療缺血性疾病的療效提供理論依據(jù)。
材料:20份臍血,每份50 ml(來源于暨南大學附屬第一醫(yī)院,均簽署知情同意書并獲醫(yī)院科研倫理委員會同意)。
試劑及儀器:EGM-2培養(yǎng)基(Lonza公司,瑞士);人淋巴細胞分離液(LymphoprepTM,Axisshield 公司,挪威);胰蛋白酶(Tryptase,Sigma 公司,美國);小鼠抗人CD34單克隆抗體(BD公司,美國);小鼠抗人CD133單克隆抗體 (Miltenyi公司,德國); 小鼠抗人p53單克隆抗體、小鼠抗人乙?;痯53(Ac-p53)單克隆抗體和兔抗人SIRT1多克隆抗體(CST公司,美國);細胞周期檢測試劑盒和AnnexinV/PI 細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司,中國);β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所,中國);超凈工作臺(SW-CJ-2F,蘇凈集團安泰空氣公司,中國);二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Formo公司,美國);倒置熒光顯微鏡(Nikon公司,日本);光學顯微鏡(OlymPus公司,日本);流式細胞儀(DB公司,美國)。
EPC分離、培養(yǎng)、擴增、鑒定方法:在胎盤、臍帶與母體和胎兒完全分離以后,無菌條件下取臍血約50 ml。臍血中加入肝素(20 U/ml)抗凝,以1 000 rpm離心10 min,吸除上清液,以10 ml含10%小牛血清的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋細胞,加入人淋巴細胞分離液15 ml,以2 000 rpm離心15 min,輕輕旋轉(zhuǎn)吸取呈乳白色的第2層單核細胞(MNC)層,加入EGM-2培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)細胞密度為 1×105/cm2,置于12.5 ml培養(yǎng)瓶內(nèi),在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細胞擴增情況,待細胞長滿到細胞瓶80%左右傳代。采用免疫熒光技術(shù)對第二代細胞進行EPC細胞標志物CD133、CD34鑒定。觀察第三代和第六代細胞在衰老、凋亡、周期和血管形成等方面的差異,檢測第三代和第六代細胞p53、乙?;膒53(Ac-p53)、SIRT1的表達情況。構(gòu)建攜帶干擾SIRT1的miR-34a抑制因子的慢病毒載體(由復能基因有限公司構(gòu)建合成),以第六代EPC作為實驗對象,以空載慢病毒轉(zhuǎn)染EPC作為對照組,miR-34a抑制因子慢病毒載體轉(zhuǎn)染EPC作為轉(zhuǎn)染組,檢測兩組細胞p53和SIRT1的表達差異,觀察兩組細胞在衰老、凋亡和血管形成等方面的差異,明確外源性miR-34a抑制因子能否延緩EPC的凋亡。
流式細胞儀測定EPC凋亡率:采用AnnexinVFITC/PI雙染色法流式細胞術(shù)檢測EPC的凋亡率。0.25%胰酶消化收集各組細胞,PBS洗滌2次,2 000 rpm離心5 min,棄上清,收集5×105個細胞,加0.5 ml結(jié)合緩沖液重懸細胞;加入5 μl AnnexinV-FITC,混勻后在加入5 μl PI,混勻并室溫避光反應10~20 min,在1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測。流式細胞儀檢測結(jié)果分析:左下象限為陰性正常細胞(Annexin V-/PI-);右上象限為晚期凋亡細胞(Annexin V+/PI+);右下象限為早期凋亡細胞(Annexin V+/PI-)。
流式細胞儀分析EPC細胞周期:收集各組細胞,用PBS洗滌1次,2 000 rpm離心5 min,重懸細胞,調(diào)整濃度為1×106/ml,取1 ml細胞懸液2 000 rpm離心5 min,棄上清,加入500 μl 70%冷乙醇固定,4℃過夜;離心后棄乙醇,PBS洗滌1次后加入100 μl 5'核酸內(nèi)切酶,37℃孵育30 min,再加入500 μl PI染色,4℃避光反應30 min;流式細胞儀檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光,分析數(shù)據(jù)。
β-半乳糖苷酶染色標記EPC衰老細胞:β-半乳糖苷酶染色試劑以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)為底物,只有衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍色產(chǎn)物。0.25%胰蛋白酶消化細胞后以5×103/孔的細胞密度種植在12孔板中;次日吸除細胞培養(yǎng)液,PBS洗滌1次,每孔加入500 μl β-半乳糖苷酶染色固定液,室溫固定15 min;PBS洗3次,每次3 min;每孔加入500 μl染色工作液;37℃恒溫水浴箱中孵育過夜;普通光學顯微鏡下觀察、計數(shù)藍染的細胞。
EPC血管形成實驗:將保存于-20℃的基質(zhì)膠拿出4℃過夜解凍;12孔板和槍頭都提前放在-20℃冰箱降溫30 min;把基質(zhì)膠加入12孔板之后4℃放置20 min,再室溫放置30 min,后放入37℃孵箱30 min;每孔種植EPC 1.5×105個,于6 h光學顯微鏡下觀察細胞血管形成情況。
蛋白質(zhì)印跡法檢測EPC中p53、Ac-p53、SIRT1蛋白的表達:PBS洗待測細胞2 次,每孔加入 120 μl裂解液,含 1.2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF);細胞刮刀收集細胞于1.5 ml離心管中,冰上放置30 min,讓細胞充分裂解;12 000 g(4℃)離心15 min收集上清至EP管中冰上放置;使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。5×上樣緩沖液加入到已調(diào)整好濃度的蛋白樣品中,煮沸5 min使蛋白變性,-20℃保存?zhèn)溆?。配?0%蛋白電泳分離膠和5%濃縮膠,取30 μg蛋白上樣,電泳80 V/180 min,半干法轉(zhuǎn)膜15 V/20 min;5%脫脂奶粉/TBS-T(加了Tween的三乙醇胺緩沖鹽水溶液)封閉聚偏二氟乙烯(PVDF)膜1 h;一抗稀釋液配置一抗p53、Ac-p53和 SIRT1(1:1 000)孵育 PVDF膜 4℃過夜,TBS-T 洗滌5次;TBS-T 稀釋相應的二抗(1:6 000),室溫孵育 PVDF膜 1 h;TBS-T 洗滌 5次。凝膠成像系統(tǒng)掃描PVDF膜,Imag-J測量光密度值,以目的蛋白和β-肌動蛋白帶的密度比值表示目的蛋白表達水平。
攜帶miR-34a 抑制因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前24 h,將細胞以1×105/孔種植到24孔板中。使細胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時的數(shù)量為2×105/孔左右。次日用含6 μg/ml聚凝胺的2 ml新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基,加入16 μl慢病毒懸液(最適感染復數(shù)MIO值≈15.3;miR-34a 抑制因子慢病毒滴度=1.9×108TU/ml)。37℃孵育,4 h后加入2 ml新鮮培養(yǎng)基以稀釋聚凝胺。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng),48 h后進行相關(guān)實驗。
統(tǒng)計學方法:用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間差異采用t檢驗方法,P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
培養(yǎng)3 d后,EPC開始貼壁生長,細胞多呈長梭形。7 d左右,出現(xiàn)由多角形和梭形細胞組成的小集落,隨后細胞迅速生長。約10~14 d可出現(xiàn)大面積集落,呈典型鋪路石樣,即為EPC 細胞集落。取第二代EPC進行鑒定,免疫熒光技術(shù)檢測CD34、CD133均呈陽性反應,符合EPC表型特點。
EPC在傳代的過程中發(fā)生了復制性衰老。與第三代EPC相比,顯微鏡下第六代EPC凋亡脫落的細胞較多;β-半乳糖苷酶染色顯示,第六代EPC衰老細胞明顯增多 [(7.0±2.8)% vs(31.2±5.4)%,P<0.05];第六代EPC的血管形成能力也明顯減弱(P<0.05)。
圖1 第三代與第六代血管內(nèi)皮祖細胞顯微鏡下狀態(tài)、衰老及血管形成能力比較(×10,n=3)
第六代EPC中p53表達量高于第三代EPC,相反Ac-p53表達量則比第三代EPC少,SIRT1的表達量也低于第三代EPC(P均<0.05)。
與第三代EPC相比,第六代EPC大部分阻滯于G0/G1期,S 期及G2/M期減少。AnnexinV-FITC/PI雙染色結(jié)果顯示,第六代EPC晚期凋亡率高于第三代EPC,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
圖2 第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細胞中p53、Ac-p53和SIRT1蛋白的表達差異(n=3)
表1 流式細胞術(shù)檢測第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細胞各細胞周期比例和凋亡率(%,±s,n=3)
表1 流式細胞術(shù)檢測第三代和第六代血管內(nèi)皮祖細胞各細胞周期比例和凋亡率(%,±s,n=3)
注:EPC:內(nèi)皮祖細胞。與第三代同期EPC比較**P<0. 01 *P<0. 05
第三代 74.30±1.01 2.57±1.05 18.13±4.46 2.1±0.64.2±1.2
蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組的SIRT1蛋白表達較對照組明顯增多[(1.35±0.04) vs(1.00±0.03),P<0.05],p53蛋白表達則明顯減少[(0.65±0.08) vs (1.00±0.07),P<0.01 ]。
圖3 第六代血管內(nèi)皮祖細胞對照組和轉(zhuǎn)染組中SIRT1 和p53蛋白表達情況(n=3)
與對照組相比,轉(zhuǎn)染組衰老情況有所改善,血管形成能力也增強,晚期凋亡率明顯減少[(9.46±3.61)% vs(3.72±3.64)%,P<0.01]。
圖4 第六代血管內(nèi)皮祖細胞對照組和轉(zhuǎn)染組細胞衰老、血管形成能力及細胞凋亡情況(×10,n=3)
EPC作為具有增殖潛能的血管內(nèi)皮細胞前體細胞,不僅參與生理性血管形成,在多種病理狀態(tài)下也能被動員出骨髓并分化為成熟內(nèi)皮細胞,促進形成新生血管,緩解組織缺血和修復血管損傷[4]。研究表明,血循環(huán)中的EPC可來源于多種組織,如骨髓、髓外的脂肪組織、脾臟、肌肉、動脈外膜等,臍帶血及臍帶組織也是EPC體外研究重要的來源之一。另外,循環(huán)中的多能干細胞也可以在細胞因子刺激下分化為EPC。EPC能顯著改善肢體缺血[5]。Kalka等[6]報道,接受人EPC治療的小鼠下肢血流量明顯增加,缺血肢體成活率顯著提高。作為干細胞的一種,EPC治療缺血性疾病在動物模型中的短期療效已有諸多報道,但其長期治療效果和安全性少有報道,在臨床中也未得到廣泛應用。
細胞復制性衰老是指細胞經(jīng)過一定次數(shù)的分裂后進入不可逆的細胞周期阻滯狀態(tài)。正常體細胞在體外經(jīng)歷一段時間的培養(yǎng)后,細胞會停止增殖進入衰老狀態(tài),無法繼續(xù)傳代培養(yǎng),惡性腫瘤細胞則不進入衰老狀態(tài)而能保持持續(xù)的增殖狀態(tài)。衰老和腫瘤的關(guān)系非常密切,隨著年齡的增加,衰老細胞數(shù)量增加,腫瘤的發(fā)生率也逐漸增加,特別是在更新頻繁的組織中更加明顯,例如造血系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[7,8]。復制性衰老可能是影響EPC長期療效的重要因素,基于現(xiàn)有的理論和實驗結(jié)果,推測細胞凋亡過度是EPC衰老的原因之一[9]。p53是重要的凋亡調(diào)節(jié)因子。SIRT1是組蛋白去乙?;窼irtuin家族的成員,參與了多種重要抗衰老基因的調(diào)控等諸多細胞活動[10]。SIRT1能對p53蛋白去乙?;?,從而使p53蛋白活性下降。miR-34a能抑制SIRT1及細胞周期調(diào)節(jié)蛋白CDK等的基因表達,進而加速細胞衰老,提示miR-34a在衰老的調(diào)控中可能發(fā)揮著重要的作用[1]?;罨蟮膒53也能增加miR-34a表達,miR-34a可通過抑制SIRT1的產(chǎn)生,而促進p53的活化。由此推測,p53-miR-34a-SIRT1形成的正反饋環(huán)在細胞凋亡和增殖的過程中扮演者重要的角色。
本課題通過研究進一步證實了EPC的復制性衰老,該衰老途徑與SIRT1對p53的去乙?;嚓P(guān);隨著細胞的傳代,SIRT1的表達減少,p53的活性增強,通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控阻滯細胞周期,啟動細胞衰老和凋亡并降低了細胞的血管形成能力。外源性的miR-34a 抑制因子可減少SIRT1在EPC細胞分裂過程中的損失,保持細胞p53的活性,減少了EPC的凋亡并可達到延緩EPC衰老的進程。因此,由p53-miR-34a-SIRT1構(gòu)成的正反饋環(huán)在EPC的復制性衰老過程中有著重要的意義,miR-34a 抑制因子可能是延緩EPC衰老的靶點,可為缺血性疾病的治療提供科學依據(jù),但其具體調(diào)控機制仍需進一步研究。
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