基于微型DNA條形碼的多種動(dòng)物源性成分的鑒定

潘艷儀，邱德義，陳 健，楊維東，岳巧云,*

（1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 中山 528403）

近年來(lái)，國(guó)際貿(mào)易及國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上各種肉類(lèi)假冒以及以次充好的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[1]。經(jīng)過(guò)2013年歐盟的“馬肉風(fēng)波”，人們對(duì)食品成分的真實(shí)性越來(lái)越關(guān)注[2]。食品摻假造假問(wèn)題嚴(yán)重危害了人類(lèi)健康和廣大消費(fèi)者的利益，引發(fā)宗教矛盾，甚至影響國(guó)家之間的關(guān)系[3]。隨著工業(yè)技術(shù)的發(fā)展，食品摻假技術(shù)不斷翻新，迫使食品成分真實(shí)性的鑒定技術(shù)不斷地發(fā)展和改善。由此，可靠、有效的動(dòng)物源性物種鑒定方法、技術(shù)是識(shí)別食品摻假造假的有力技術(shù)保障。

在過(guò)去的20年，DNA的分子檢測(cè)技術(shù)快速發(fā)展并應(yīng)用，如分子指紋圖譜技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。PCR技術(shù)中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR、限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR和巢式PCR技術(shù)等在食品成分物種鑒定領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用[4-7]。其中，普遍使用的是具有高靈敏度的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。但因?yàn)樵摷夹g(shù)使用特異的探針和引物，只能猜測(cè)性地鑒定特定某個(gè)物種，不適合于復(fù)雜未知的動(dòng)物源性多成分的鑒定，而市場(chǎng)加工食品中可能同時(shí)混有多種成分。此外，有些物種的特異性探針和引物難以設(shè)計(jì)，從而成為了多種動(dòng)物源性成分鑒定的應(yīng)用瓶頸。

自2003年，加拿大動(dòng)物學(xué)家Paul Hebert教授首次提出DNA條形碼的概念，分子分類(lèi)學(xué)方法以及分子鑒別技術(shù)在生物物種鑒定方面發(fā)揮了重要作用[8-9]。近年來(lái)，隨著DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)媒介生物的物種鑒定[10]，并開(kāi)始應(yīng)用于動(dòng)物源性食品成分的鑒定[11-15]。

DNA條形碼是源于線粒體基因組中細(xì)胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase I ，COI）基因的一段658 bp的DNA序列。此外，DNA條形碼的適用范圍很廣（從低等的節(jié)肢動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物），有較大的通用性，可以同時(shí)適用于多種動(dòng)物種類(lèi)的鑒定。而一些深加工食品的DNA會(huì)存在不同程度的降解[16]，其中某些物種成分可能會(huì)由于DNA高度降解而不能被檢出。為了適用加工食品尤其是深加工食品中動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，微型的DNA條形碼的研發(fā)是該技術(shù)提升的一個(gè)突破口。2008年，DNA的微型條形碼被首次提出，對(duì)久置的生物標(biāo)本實(shí)現(xiàn)了高效的物種鑒定[8]。繼而，也有研究者使用coi基因和12S、16S核糖體RNA基因的短片段對(duì)動(dòng)物膳食和飼料樣品進(jìn)行了物種鑒定[11]，但各研究者所使用的短片段不如標(biāo)準(zhǔn)的DNA條形碼片段那樣非常統(tǒng)一，況且目前仍沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的微型DNA條形碼用于動(dòng)物源性食品成分的鑒定[17]。因此，設(shè)計(jì)具有適度保守性和通用性的微型DNA條型碼應(yīng)用于食品成分（尤其是深加工食品）的鑒定很有必要。

本研究針對(duì)常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物物種，基于coi基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物，結(jié)合微型DNA條形碼和克隆測(cè)序技術(shù)對(duì)混合的肉樣品成分實(shí)現(xiàn)一次性準(zhǔn)確、高效的鑒定。以便進(jìn)一步應(yīng)用于未知成分的肉糜制品或深加工肉類(lèi)食品的多種肉源性成分的檢出。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本的選取和種類(lèi)的確定

選取了11 種常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)物種以驗(yàn)證引物的適用性和通用性。這11 個(gè)物種的新鮮肉類(lèi)樣品從廣東中山市某市場(chǎng)購(gòu)得，并初步判定為鯰魚(yú)、草魚(yú)、馬頭魚(yú)、藍(lán)圓鲹、家雞、鷓鴣、黃牛、水牛、家豬、綿羊和對(duì)蝦。

使用DNA條形碼的分子鑒定技術(shù)確定樣品的物種[10]。用coi通用引物（LCO1490、HCO2198）[18]擴(kuò)增出目的片段后，通過(guò)Sanger測(cè)序獲得658 bp目的序列，再于BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)（生命條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.boldsystems.org/）進(jìn)行序列比對(duì)，以與參考序列達(dá)到99.8%相似度為標(biāo)準(zhǔn)確定樣品物種。

1.1.2 試劑

DNA提取試劑盒（目錄號(hào)DP304）、瓊脂糖凝膠回收試劑盒（目錄號(hào)DP210）、克隆試劑盒（目錄號(hào)VT202-02）、重組菌落鑒定試劑盒（目錄號(hào)VI102）、dNTP、Loading buffer、DNA Marker II、SYBR Green I天根生化科技（北京）有限公司；Ex-Taq DNA聚合酶大連寶生物工程有限公司；引物由Thermo Fisher Scientific Inc廣州公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ThermoPico 17微量臺(tái)式離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀 北京科學(xué)深藍(lán)科技有限公司；Veriti 96梯度PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；MD-02N-220金屬浴 美國(guó)Major Science公司；Alliance 4.7 Thermo UVITEC凝膠成像儀 英國(guó)Uvitec公司；量程可調(diào)移液器。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

從BOLD和GenBank（美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載了140 條源于動(dòng)物coi基因的序列，包括了28 個(gè)屬（石雞屬、原雞屬、鴨屬、雁屬、鯰魚(yú)屬、鲇魚(yú)屬、黃鱔屬、馬頭魚(yú)屬、鯧魚(yú)屬、非鯽屬、麗鯛屬、圓鯵屬、鱸魚(yú)屬、草魚(yú)屬、鰱魚(yú)屬、鯉魚(yú)屬、鯽魚(yú)屬、泥鰍屬、對(duì)蝦屬、龍蝦屬、白蝦屬、長(zhǎng)臂蝦屬、疣豬屬、豬屬、黃牛屬、水牛屬、山羊?qū)俸脱驅(qū)伲┖?1個(gè)動(dòng)物物種（25 種魚(yú)、6 種蝦、10 種家禽、3 種豬、3 種牛和4 種羊）。選取的物種基本上都是常見(jiàn)的作為商品肉食的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物及其近緣種，每個(gè)物種有2或3條源于不同個(gè)體的序列。目的是尋找具有較小同種個(gè)體間差異和較大種間差異的區(qū)域，而且引物的位點(diǎn)要有足夠的保守性和通用性。用MEGAv. 6.0.6（分子進(jìn)化遺傳分析軟件）進(jìn)行多序列比對(duì)[19]，結(jié)合引物設(shè)計(jì)的一般原則，選取了一段長(zhǎng)度為136 bp目的片段。使用Oligo 7.0對(duì)所選引物的特性（引物二聚體、發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在其他位點(diǎn)錯(cuò)誤引發(fā)的效率等）進(jìn)行理論上的分析和評(píng)價(jià)[20]。再使用BLAST（基本局部比對(duì)搜索工具h(yuǎn)ttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）檢驗(yàn)引物的特異性。經(jīng)過(guò)綜合分析，最終確定了最佳的一對(duì)引物序列如下：正向引物為5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，即標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼的正向引物L(fēng)CO1490[18]；反向引物為5’-ACT ATAAAGAAGATTATTACAAAGGC-3’。

1.3.2 引物通用性分析

由于本實(shí)驗(yàn)的正向引物源于標(biāo)準(zhǔn)條形碼的正向引物序列，其引物本身對(duì)多種動(dòng)物物種都具有較高的通用性[8]。為評(píng)估這一對(duì)引物對(duì)所選物種的通用性，對(duì)引物的保守位點(diǎn)和引物與各屬內(nèi)物種的同源性進(jìn)行分析。使用MEGAv. 6.0.6軟件對(duì)各屬物種序列的引物區(qū)域與反向引物序列進(jìn)行多序列比對(duì)，對(duì)引物位點(diǎn)的核酸堿基組成情況進(jìn)行整合分析。

1.3.3 樣品前處理和DNA的提取

為了防止不同肉之間的交叉污染，樣品處理前，每把剪刀都經(jīng)高溫高壓處理，并紫外照射30 min，而且在同一次混合操作中，一把剪刀對(duì)應(yīng)一種肉。每種肉樣品都要用無(wú)菌的剪刀剪取其內(nèi)部肌肉組織。肉類(lèi)樣品設(shè)為A和H兩組：A組是11 個(gè)物種的肉獨(dú)立樣品，H組是由上述的11 個(gè)物種的生鮮肉等比例混合的樣品。對(duì)11 個(gè)物種的生鮮肉樣各剪取0.03 g組成A組的獨(dú)立樣品。再以同樣的方式對(duì)11 種肉類(lèi)樣品各剪取0.01 g，充分磨碎并混勻形成H組的混合肉樣品。H組中的混合樣品設(shè)置了3 個(gè)平行。按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)提取全基因組DNA。

1.3.4 PCR擴(kuò)增條件

A組和H組的樣品經(jīng)DNA提取后，按以下擴(kuò)增條件獲取目的片段：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、48 ℃退火30 s、68 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：10 倍PCR緩沖液5 μL；正向引物（20 nmol/μL）1 μL；反向引物（20 nmol/μL）1 μL；dNTP（10 nmol/μL）2 μL；Ex-Taq（5 U/μL）1 μL；模板DNA（50 ng/μL）3 μL；無(wú)菌水定容到50 μL。

1.3.5 直接測(cè)序

把A組11 個(gè)獨(dú)立的物種樣品的PCR產(chǎn)物送交上海立菲生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序引物同擴(kuò)增引物。使用DNA MAN軟件[21]和MEGA軟件對(duì)測(cè)序公司返回的序列進(jìn)行序列拼接和序列處理（去除引物和堿基校對(duì)），再進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯校對(duì)無(wú)誤后，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)和相似度分析，對(duì)序列進(jìn)行物種注釋。

1.3.6 DNA純化

把H組混合肉類(lèi)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.3.7 克隆測(cè)序

采用pGM-T連接試劑盒，按照試劑盒的使用手冊(cè)對(duì)H組樣品的純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后把產(chǎn)物置于37 ℃進(jìn)行菌液擴(kuò)大培養(yǎng)1 h，再把菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白色菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè)，以確定克隆的有效性。最終每個(gè)樣品隨機(jī)挑選130個(gè)陽(yáng)性菌株送交上海立菲生物科技有限公司測(cè)序。以上述方法1.3.5節(jié)同樣的方式對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析和物種注釋。

1.3.8 比對(duì)微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的對(duì)物種鑒定的效果

基于140 條、51 個(gè)物種的coi基因的DNA序列（序列來(lái)源與1.3.1節(jié)所述的一致），序列分別處理為長(zhǎng)度為136 bp的微型條形碼序列和長(zhǎng)度為658 bp的標(biāo)準(zhǔn)條形碼序列，再用MEGA v.6.0.6軟件，選用鄰接（Neighbor joining，NJ）法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)及其默認(rèn)參數(shù)值（P-distance模式、檢測(cè)次數(shù)為500等），分別構(gòu)建微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以比較微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的對(duì)物種鑒定的效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的通用性分析

對(duì)所選的28 個(gè)屬、140 條序列的反向引物區(qū)域的同源性分析情況如表1所示。反向引物序列區(qū)域中共有17 個(gè)完全保守位點(diǎn)，分別以“*”標(biāo)記。28 個(gè)屬中，共有14 個(gè)屬具有較高同源性（少于2 個(gè)差異位點(diǎn)）：豬屬、雁屬、鲇魚(yú)屬、馬頭魚(yú)屬、非鯽屬、鯉魚(yú)屬、石雞屬、鯰魚(yú)屬、圓鯵屬、草魚(yú)屬、鰱魚(yú)屬、鯽魚(yú)屬、長(zhǎng)臂蝦屬和黃牛屬。有4 個(gè)屬具有較低同源性（4～5個(gè)差異位點(diǎn)）：黃鱔屬、對(duì)蝦屬、龍蝦屬和白蝦屬。其余的10 個(gè)屬具有中等的同源性（3 個(gè)差異位點(diǎn)）。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)引物的適用性和通用性，選取源于3 種不同的同源性水平的11 個(gè)物種（表1中以上標(biāo)“1”標(biāo)記）進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，擴(kuò)增的目的片段如圖1所示。

表1 28 個(gè)屬內(nèi)物種與引物的同源性Table 1 Sequence homology with primers among species of 28 genera

圖1 11 個(gè)物種的目的片段Fig. 1 Target fragments for 11 species

2.2 樣品物種的鑒定

經(jīng)DNA條形碼分子鑒定，11 個(gè)樣品的目的序列都能與BOLD條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的參考序列達(dá)99.8%以上的相似度，達(dá)到物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，確定樣品的物種如下：鯰魚(yú)、草魚(yú)、馬頭魚(yú)、藍(lán)圓鲹、原雞、石雞、黃牛、水牛、家豬、綿羊和凡納濱對(duì)蝦。

2.3 微型DNA條形碼鑒定物種的準(zhǔn)確性

A組的11 個(gè)物種的基因組DNA都能被成功提取并高效擴(kuò)增出長(zhǎng)度為136 bp的目的片段，如圖1所示。測(cè)序后返回的DNA序列經(jīng)序列處理和分析，并蛋白質(zhì)翻譯校對(duì)無(wú)誤后，結(jié)合BOLD數(shù)據(jù)庫(kù)的參考序列和GenBank的匹配序列，所有目的片段和對(duì)應(yīng)的兩種序列都有100%的相似度，即對(duì)每個(gè)物種的鑒定都準(zhǔn)確地達(dá)到了種的水平[8,22]（表2）。

表2 11 個(gè)樣品物種的微型DNA條形碼的鑒定結(jié)果Table 2 Identification of 11 species based on mini-DNA barcode

2.4 混合肉樣品的克隆測(cè)序結(jié)果

H組3 個(gè)平行的混合肉樣品中的390 個(gè)陽(yáng)性克隆經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序后，其中絕大部分的陽(yáng)性克隆都能被成功測(cè)序并獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果，只有3.6%的陽(yáng)性克隆測(cè)序失敗或者序列比對(duì)結(jié)果不佳，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的克隆測(cè)序法的陽(yáng)性克隆具有較高的有效性。經(jīng)序列處理和序列分析后，各物種的微型條形碼序列（136 bp）幾乎都能與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列達(dá)到100%的相似度，說(shuō)明微型條形碼與克隆測(cè)序法結(jié)合后，對(duì)物種鑒定依然具有較高的準(zhǔn)確度。綜合3 個(gè)平行樣品，除了原雞和藍(lán)圓鲹，其余9 個(gè)物種皆一并檢出（圖2）。進(jìn)一步分析各個(gè)物種的序列豐度，不同物種之間被檢出的概率差異較大?；旌蠘悠分婿T魚(yú)、石雞、黃牛和綿羊物種的檢出概率較高，其檢出概率的范圍為7.7%～54.0%，而其余物種的檢出概率的范圍為0%～1.5%（按3 個(gè)平行樣品物種序列數(shù)的均值計(jì)算）。

圖2 混合樣品各物種被檢出的陽(yáng)性克隆數(shù)Fig. 2 Number of detected positive clones of each specie from mixed meat samples

2.5 微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼的NJ樹(shù)的比較分析

基于140 條51 個(gè)常見(jiàn)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)物種的coi基因序列，構(gòu)建出微型條形碼（136 bp）與標(biāo)準(zhǔn)條形碼（658 bp）的NJ樹(shù)見(jiàn)圖3。由圖3a可見(jiàn)，28 個(gè)不同的屬（每個(gè)屬已在方法的1.3.1節(jié)中一一列舉）都能得到明確的區(qū)分。除了原雞屬、雁屬、亞口魚(yú)屬、羅非魚(yú)屬和綿羊?qū)賰?nèi)的物種序列之間有較高的相似度，其他的21個(gè)屬內(nèi)各物種的種間距離基本都大于2%，達(dá)到了物種區(qū)分的界限[22]。屬內(nèi)種間差異較小的物種有：原雞和灰原雞，雪雁、豆雁、灰雁和白額雁，莫桑比克羅非魚(yú)和尼羅羅非魚(yú)，黑鯽和鯽魚(yú)，扁吻亞口魚(yú)和圣安娜亞口魚(yú)，銀鯧魚(yú)和翎鯧魚(yú)以及落基山脈大角羊和白大角羊（圖3已標(biāo)注）。另一方面，除銀鯧魚(yú)外，其余的50 個(gè)物種種內(nèi)的不同個(gè)體的序列之間都擁有高于98%的相似度，即個(gè)體差異小于種間差異，達(dá)到種內(nèi)保守。標(biāo)準(zhǔn)條形碼的NJ樹(shù)（圖3b）的各屬內(nèi)物種差異較小的物種較少，但原雞屬、雁屬及綿羊?qū)賰?nèi)的種間差異也小于2%（圖3已標(biāo)注）。種內(nèi)個(gè)體差異較大的物種較多，包括了銀鯧魚(yú)、阿氏六須鯰和鰱魚(yú)。

圖3 微型條形碼（a）和標(biāo)準(zhǔn)條形碼（b）的NJ進(jìn)化樹(shù)（P-distance模式）Fig. 3 Neighbor joining trees of mini-barcode and standard barcode(P-distance model)

比對(duì)分析微型條形碼與標(biāo)準(zhǔn)的條形碼的NJ樹(shù)，兩者在區(qū)分所選物種的種間和種內(nèi)的能力上有高度的一致性。說(shuō)明微型條形碼盡管片段較短，也依然能保留標(biāo)準(zhǔn)條形碼基本的物種分類(lèi)能力，能對(duì)所選的大部分的物種實(shí)現(xiàn)較好的物種分類(lèi)和鑒定。

3 討 論

3.1 引物的通用性

經(jīng)140 條序列的反向引物區(qū)域同源性的分析，26 個(gè)引物位點(diǎn)中有17 個(gè)完全保守位點(diǎn)。雖然引物3末端的5 個(gè)堿基不是連續(xù)的完全保守位點(diǎn)，但以G、C堿基（完全保守位點(diǎn)）為末端的引物一般與模板結(jié)合時(shí)具有較高的穩(wěn)定性，能增加引物與模板的總體結(jié)合力。而且后續(xù)的驗(yàn)證引物的適用性和通用性的實(shí)驗(yàn)表明引物能對(duì)不同引物同源性水平的11 種個(gè)肉類(lèi)物種（豬、牛、羊、雞、魚(yú)和蝦）的目的序列進(jìn)行高效的擴(kuò)增，并得到高質(zhì)量的序列測(cè)序結(jié)果。雖然引物的同源性分析反映了該引物對(duì)所選的51 個(gè)動(dòng)物經(jīng)濟(jì)物種有一定的通用性，且對(duì)所選的11 個(gè)物種序列有良好的擴(kuò)增效率，但仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以對(duì)引物通用性進(jìn)行更全面的檢驗(yàn)。

3.2 克隆測(cè)序法的檢測(cè)效果

在混合樣品中9 個(gè)物種一并檢出并得到準(zhǔn)確鑒定，物種成分的檢測(cè)在總體達(dá)到了較高的檢出效率，但仍然有2 個(gè)物種未能檢出。由于克隆法自身的局限性，難以對(duì)多組分樣品的成分進(jìn)行全面檢出。進(jìn)一步分析各物種被檢出的序列豐度，不同物種之間的檢出概率差異較大，這可能源于混合樣品的各個(gè)成分中在PCR擴(kuò)增過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)[23-24]。對(duì)于那些具有相對(duì)較低的擴(kuò)增效率的物種，則呈現(xiàn)較低的檢測(cè)概率。另一方面，克隆測(cè)序法對(duì)混合樣品成分的檢測(cè)具有一定的隨機(jī)性，而導(dǎo)致了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性較低。這與挑取陽(yáng)性克隆的相對(duì)豐度以及選取陽(yáng)性克隆的隨機(jī)性有關(guān)。

3.3 微型DNA條形碼的適用性和前景性

選取的11 個(gè)物種皆能通過(guò)本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的通用引物成功擴(kuò)增出136 bp的目的片段并得到準(zhǔn)確的物種鑒定（皆與數(shù)據(jù)庫(kù)的目的物種序列有100%的相似度），說(shuō)明該微型DNA條形碼可準(zhǔn)確鑒定這11 種肉類(lèi)成分，可進(jìn)一步應(yīng)用于深加工食品或復(fù)雜成分食品的多種動(dòng)物源性成分的檢測(cè)。

此外，經(jīng)過(guò)微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼的鄰接樹(shù)的對(duì)比分析，微型條形碼對(duì)所選的51 個(gè)常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)物種的分類(lèi)鑒定能力與標(biāo)準(zhǔn)條形碼高度相似。由于微型條形碼的序列僅有136 bp，對(duì)某些在coi基因片段中具有極少差異位點(diǎn)的近緣物種（2.5節(jié)）則難以區(qū)分。除去種間差異較小的8 個(gè)物種和種內(nèi)個(gè)體差異較大的1 個(gè)物種，該微型條形碼對(duì)其余的42 個(gè)物種都具有較好的種間和種內(nèi)的區(qū)分能力。針對(duì)克隆測(cè)序法難以對(duì)于含有較多成分樣品達(dá)到全面檢出的情況，近年來(lái)，已有一些研究者開(kāi)始借助二代測(cè)序平臺(tái)對(duì)多種動(dòng)植物源性成分進(jìn)行鑒定[25-27]。由于現(xiàn)今市場(chǎng)上常用的二代測(cè)序平臺(tái)有讀長(zhǎng)長(zhǎng)度限制[28-29]，盡管采用PE300的測(cè)序策略，最多只能檢測(cè)長(zhǎng)度為550 bp的擴(kuò)增片段。所以，標(biāo)準(zhǔn)的條形碼658 bp由于長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)而不能直接應(yīng)用于二代測(cè)序平臺(tái)。因此，也有一些研究者結(jié)合一種或多種微型條形碼和二代測(cè)序技術(shù)，進(jìn)而對(duì)復(fù)雜的、未知的樣品成分的進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，如蜂蜜成分的鑒定，花粉混合物的物種來(lái)源鑒定及糖果中動(dòng)物物種成分分析等[29-31]。由于本實(shí)驗(yàn)的微型條形碼和標(biāo)準(zhǔn)條形碼在動(dòng)物物種分類(lèi)的能力上有高度的一致性，而且長(zhǎng)度符合二代測(cè)序的讀長(zhǎng)要求，所以能進(jìn)一步與二代測(cè)序平臺(tái)結(jié)合，進(jìn)而對(duì)復(fù)雜、未知的食品中多種動(dòng)物源性成分進(jìn)行全面的檢測(cè)和鑒定。

4 結(jié) 論

單個(gè)樣品的Sanger測(cè)序和混合樣品的克隆測(cè)序結(jié)果皆顯示，本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的微型條形碼對(duì)于多種動(dòng)物源性物種成分，包括魚(yú)、蝦、雞、豬、牛和羊的鑒定有高度的準(zhǔn)確性?？寺y(cè)序法能對(duì)混合樣品的物種成分達(dá)到較高的檢測(cè)效率，但同時(shí)也存在一些局限性?；谖⑿蜅l形碼與標(biāo)準(zhǔn)條形碼在物種分類(lèi)上高度的一致性，把微型條形碼與二代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，是未來(lái)在復(fù)雜食品成分快速鑒定的領(lǐng)域中進(jìn)一步的研究方向。

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