蘭 雪，張斯童，李 哲，常 浩，孫 旸，王 剛，陳 歡，王春鳳，陳 光,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118）

木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它不僅在能源工業(yè)上可發(fā)揮巨大作用，在飼料、造紙、食品等領(lǐng)域也有著廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。而制約我國木聚糖酶生產(chǎn)與應(yīng)用的主要限制性因素是缺乏能夠與規(guī)?；a(chǎn)相適應(yīng)的高產(chǎn)菌株，因此，開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)木聚糖酶新菌系迫在眉睫[3]。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是美國食品與藥品管理局認(rèn)定的一種安全菌株，是食品與飼用酶制劑表達(dá)的理想宿主[4]。釀酒酵母生物學(xué)和遺傳學(xué)背景清楚，既具有原核生物生長繁殖快、遺傳操作簡單的特點，又具有真核生物對外源蛋白進行翻譯后修飾加工的能力。近年來，在外源基因表達(dá)方面得到了深入研究和廣泛應(yīng)用[5-6]。rDNA序列是指細(xì)胞核中編碼核糖體RNA的DNA序列，它是一段高度重復(fù)序列，其重復(fù)單位由轉(zhuǎn)錄區(qū)段和非轉(zhuǎn)錄區(qū)段組成。在釀酒酵母的XII染色體中，rDNA存在100～140 個重復(fù)單位[7]。如果以釀酒酵母rDNA序列為整合位點，從理論上說，可以得到100～140 個目的基因拷貝數(shù)。依賴于rDNA介導(dǎo)整合的外源基因?qū)脶劸平湍负?，外源基因在酵母?xì)胞內(nèi)的表達(dá)會由于劑量效應(yīng)而實現(xiàn)高效表達(dá)[8]。但研究發(fā)現(xiàn)，基因拷貝數(shù)在一定的范圍內(nèi)與蛋白表達(dá)量成正相關(guān)，通常在4～9 拷貝左右，超過這個范圍，蛋白表達(dá)水平反而降低[9-10]。

微滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）是近年來興起的一種新的基因絕對定量技術(shù)，通過極度稀釋實現(xiàn)理論上的單分子擴增，然后用終點法PCR和泊松分布計算出樣品的原始濃度，具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)真正意義上的絕對定量[11-12]。

本研究利用rDNA整合法構(gòu)建多拷貝木聚糖酶釀酒酵母工程菌，并利用ddPCR技術(shù)對其拷貝數(shù)進行定量分析，并對不同拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)木聚糖酶活力進行測定，探討基因拷貝數(shù)和酶活力之間的關(guān)系，以期為木聚糖酶生產(chǎn)菌株的構(gòu)建和改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichaa coli）DH5α為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物物理研究室保存菌種；黑曲霉CICC2462菌株中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；釀酒酵母INVSc1（MATa、his3、leu2、trp1、ura3）、質(zhì)粒pYES2（圖1）中國工業(yè)微生物質(zhì)粒菌種保藏中心；pMD19-T 日本TaKaRa公司。

圖1 pYES2質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Map of plasmid pYES2

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、去磷酸化試劑盒、限制性內(nèi)切酶（NotI、XbaI、SnaBI等）、T4連接酶、SD-Ura培養(yǎng)基 日本TaKaRa公司；Salmon Sperm DNA 上海源葉生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限責(zé)任公司；酵母基因組提取試劑盒 美國Omega公司；ddPCR EvaGreen Supermix、Droplet reader oil 美國Bio-Rad公司；總RNA提取試劑盒 美國Axygen公司；木聚糖美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

QX200型ddPCR儀、Universal hood III全能發(fā)光系統(tǒng)、電泳儀 美國Bio-Rad公司；PCR擴增儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 xynB基因克隆

1.3.1.1 黑曲霉CICC2462總RNA提取

將黑曲霉CICC2462菌種經(jīng)平板活化后，制備種子液，將種子液接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后，收集菌體，用總RNA提取試劑盒提取RNA[13]。

1.3.1.2 引物設(shè)計

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中黑曲霉木聚糖酶基因序列，用Primer 5.0設(shè)計引物擴增xynB基因，并引入酶切位點NotI和XbaI。上游引物F1：5’-ATTTGCGGCCG CCTAGAGAGCATTTGCGATAGC-3’，下游引物R1：5’-TG CTCTAGAATGGTTCAGATCAAGGTAGCTG-3’。

1.3.1.3 xynB基因擴增

以提取的黑曲霉總RNA為模板，用TaKaRa一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板擴增xynB基因，擴增條件見TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0說明書。瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化目的條帶[14]。

1.3.1.4 克隆載體的連接、轉(zhuǎn)化、鑒定

將回收產(chǎn)物與pMD19載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，接種到含有氨芐青霉素（ampicillin，Amp）的抗性平板上篩選。12 h后挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃、160 r/min培養(yǎng)。12 h后離心收集菌體，提取質(zhì)粒并送測序，命名為pMD19-T-xynB。

1.3.2 rDNA序列擴增

1.3.2.1 酵母菌的培養(yǎng)以及DNA提取

用YPD固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)釀酒酵母INVSc1，挑取單克隆，YPD液體培養(yǎng)2 d后，收集菌體，用OMEGA酵母基因組提取試劑盒，提取DNA[15]。

1.3.2.2 引物設(shè)計及rDNA基因擴增

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的信息，用Primer 5.0設(shè)計引物擴增2 300 bp的rDNA核心序列，并引入酶切位點SnaBI。上游引物F2：5’-ACGTACGTACAACGAACGAGACCTT AACCT-3’，下游引物R2：5’-ACGTACGTACGGAACCT CTAATCATTCGCT-3’。以釀酒酵母基因組為模板，擴增rDNA序列，擴增條件為：94 ℃預(yù)變性180 s；94 ℃變性10 s；55 ℃退火15 s；72 ℃延伸150 s；循環(huán)數(shù)為30，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化目的條帶。

1.3.2.3 克隆載體的連接、轉(zhuǎn)化、鑒定

方法同1.3.1.4節(jié)，命名為pMD19-T-rDNA。

1.3.3 表達(dá)載體pYES2-xynB-rDNA的構(gòu)建

用NotI和XbaI分別酶切載體pMD19-T-xynB和pYES2，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α，Amp抗性篩選后經(jīng)xynB菌液PCR鑒定得到質(zhì)粒pYES2-xynB，測序驗證后，用SnaBI對載體pYES2-xynB和pMD19-T-rDNA進行酶切，對回收的pYES2-xynB片段進行去磷酸化后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α。12 h后挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，挑取陽性克隆于含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃、160 r/min培養(yǎng)。12 h后離心收集菌體，提取質(zhì)粒酶切鑒定，命名為pYES2-xynB-rDNA。

1.3.4 線性化pYES2-xynB-rDNA載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母

用SphI在rDNA位置對pYES2-xynB-rDNA進行單酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后，用 LiAc/SS載體DNA/PEG化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母[16-17]，轉(zhuǎn)化體系為：感受態(tài)釀酒酵母，50 μL；50% PEG3350，240 μL；1 mol/L LiAc，36 μL；2 mg/mL boiled carrier DNA，50 μL；Plasmid DNA，34 μL。經(jīng)42 ℃孵育后，將細(xì)胞重懸于1 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150r/min培養(yǎng)1 h，收集菌體，用200 μL ddH2O重懸菌體后，將其涂布與SD-Ura平板，30 ℃培養(yǎng)3～5 d直至出現(xiàn)單菌落。對挑取的單菌落進行xynB的菌液PCR驗證。

1.3.5 ddPCR鑒定轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)

1.3.5.1 引物及探針

對得到的陽性轉(zhuǎn)化子，接種于YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，收集菌體，用真菌總RNA提取試劑盒提取釀酒酵母RNA，經(jīng)TaKaRa RNA PCR Kit （AMV） Ver.3.0反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，ATC1基因為內(nèi)參，利用ddPCR進行xynB基因拷貝數(shù)鑒定[18-19]。引物探針序列為：ATC1上游引物F3：5’-ATC1TATCCCCTGCATCCCTATCA-3’，下游引物R3：5’-CAGGCTTCGTTGCAGATACA-3’，探針：5’-HEXCATCTTCGTTAGCTTCATCCGACGCTA-BHQ-3’；xynB上游引物F4：5’-GCCGTGGACAGTTCTCTTTC-3’，下游引物R4：5’-TCATGACCCCGATGAGTGTA-3’，探針：5’-FAM-CCTGGTCAACTTTGCCCAGTCTAACAABHQ-3’。內(nèi)參基因熒光標(biāo)記基團為HEX，目的基因熒光標(biāo)記基團為FAM。

1.3.5.2 ddPCR體系和條件

ddPCR包括配制體系、生成微滴、擴增循環(huán)和信號讀取4 個步驟。ddPCR體系為20 μL，包含10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L 正向引物和反向引物各1 μL、探針0.5 μL，DNA模板2 μL。生成微滴需要使用專門的微滴生成卡和微滴生成儀，將40 μL PCR體系和70 μL微滴生成油（droplet generation oil）加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴。ddPCR擴增使用兩步法，設(shè)置程序如下：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共45 個循環(huán)，擴增結(jié)束后進行98 ℃、10 min的熱失活。每個模板重復(fù)3 個平行檢測。擴增結(jié)束后，將96 孔板置入微滴讀取儀中讀取信號，并使用軟件QuantaSoft V1.3.2.0分析分析實驗數(shù)據(jù)，獲得絕對定量結(jié)果[20-22]。

1.3.6 轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)酶實驗

將1.3.5節(jié)鑒定得到的不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子接種至半乳糖培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后，取上清液，用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測定木聚糖酶活力，具體方法見文獻[23-24]，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.127 5x－0.07，R2=0.993 5。

1.3.7 高酶活轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶穩(wěn)定性實驗

將1.3.6節(jié)得到的產(chǎn)酶活力最高的轉(zhuǎn)化子接種于半乳糖培養(yǎng)基中，進行傳代，每次傳代均在30 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后，取上清液測定木聚糖酶活力，連續(xù)傳代8 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 xynB基因和rDNA序列的克隆

以提取的黑曲霉CICC2462總RNA為模板，經(jīng)TaKaRa一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，用引物F1和R1擴增得到預(yù)期目的片段，大小為984 bp。以釀酒酵母基因組為模板，用引物F2和R2擴增得到rDNA基因片段，大小約為2 300 bp。擴增產(chǎn)物大小均符合預(yù)期，如圖2所示。

將上述基因擴增片段分別與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR驗證后，提取質(zhì)粒，經(jīng)NotI和XbaI酶切后，得到載體片段和xynB基因片段。用SnaBI酶切后，得到預(yù)期rDNA片段，如圖3所示。將測序結(jié)果與GenBank（登錄號：FJ_986225.1 和BK_006945.2）序列進行比對，相似度100%，表明xynB基因和rDNA未發(fā)生堿基突變。

圖2 xynB和rDNA片段的PCR擴增Fig. 2 PCR amplification of xynB and rDNA fragment

圖3 克隆載體pMD19-T酶切鑒定Fig. 3 Restriction enzyme digestion of recombinant vector pMD19-T

2.2 表達(dá)載體pYES2-xynB-rDNA的構(gòu)建

圖4 表達(dá)載體的酶切鑒定Fig. 4 Restriction enzyme digestion of expression vector

用NotI和XbaI分別酶切載體pMD19-T-xynB和pYES2，回收目的片段后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)xynB菌液PCR鑒定得到質(zhì)粒pYES2-xynB，測序驗證后，用SnaBI對載體pYES2-xynB和pMD19-T-rDNA進行酶切，對回收的pYES2-xynB片段進行去磷酸化后，T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化DH5α，菌液PCR驗證后，提取質(zhì)粒酶切驗證，結(jié)果如圖4所示，pYES2載體大小為5 864 bp；pYES2-xynB載體大小為6 848 bp；pYES2-xynB-rDNA大小為9 148 bp。

2.3 轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)的ddPCR檢測結(jié)果

用SphI在rDNA位置對pYES2-xynB-rDNA進行線性化后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)釀酒酵母INVSc1，對經(jīng)SD-Ura培養(yǎng)基篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用ddPCR進行轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)檢測。圖5顯示的結(jié)果為在2 個檢測通道下，檢測的陽性微滴和陰性微滴的分布轉(zhuǎn)框，圖中陽性微滴和陰性微滴區(qū)分明顯，系統(tǒng)可準(zhǔn)確判讀出陽性微滴和陰性微滴數(shù)目[25]。

圖5 ddPCR測定轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)Fig. 5 Detection of copy number of transformants by ddPCR

微滴生成是ddPCR的關(guān)鍵步驟，只有微滴數(shù)大于10 000時，DNA分子的分布才能符合泊松分布的統(tǒng)計學(xué)原理，系統(tǒng)才可以對陽性和陰性微滴進行計數(shù)。ddPCR擴增形成的微滴數(shù)如表1所示。由表1可知，反應(yīng)中形成的微滴數(shù)處于11 411～15 859之間，均大于10 000，滿足ddPCR微滴的分析要求[26-28]。根據(jù)軟件讀取的各轉(zhuǎn)化子xynB基因和ATC1基因的濃度，得出目的基因xynB的拷貝數(shù)。ddPCR分析顯示，利用rDNA整合法，成功獲得了1、2、3、5、9、10、14、16、17和18共10 種不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。

表1 ddPCR拷貝數(shù)分析結(jié)果Table 1 Estimated copy number of transformants by ddPCR

2.4 不同拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活力分析

對10 株攜帶不同拷貝數(shù)的菌株，通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過半乳糖誘導(dǎo)72 h后，取發(fā)酵液進行木聚糖酶活力測定，不同拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化子木聚糖酶活力如圖6所示，當(dāng)xynB拷貝數(shù)小于9時，木聚糖酶活力隨著拷貝數(shù)增加而增加，9 拷貝時木聚糖酶活力最高為308 U/mL，是單拷貝時的5.4 倍；超過9 拷貝后，木聚糖酶活力降低，到18 拷貝時，酶活力僅為9 拷貝時的44%。

圖6 拷貝數(shù)與酶活力之間的關(guān)系Fig. 6 Relationship between copy number and enzymatic activity

2.5 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶穩(wěn)定性分析

對得到的酶活力最高的9 拷貝轉(zhuǎn)化子，進行遺傳穩(wěn)定性研究，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，用rDNA整合法獲得的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶穩(wěn)定性較好，經(jīng)過8 次傳代后，酶活力變化微小，第8次傳代時酶活力為310 U/mL。

圖7 傳代次數(shù)與酶活力之間的關(guān)系Fig. 7 Relationship between passage number and enzymatic activity

3 討論與結(jié)論

外源基因的拷貝數(shù)是影響外源蛋白高效表達(dá)的一個重要因素。大量研究表明，增加基因的拷貝數(shù)可以有效增加外源蛋白的表達(dá)[29-30]。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員采取了多種策略來提高外源基因的拷貝數(shù)[31]，如串聯(lián)表達(dá)盒法等，但這種方式需要頻繁地構(gòu)建載體、酶切、純化回收 DNA 片段，操作繁瑣，且需要消耗大量的酶來制備線性化片段。本研究利用釀酒酵母12號染色體上rDNA多拷貝重組位點作為構(gòu)建多拷貝工程菌的方法，高效而且簡單方便，篩選得到最多18拷貝的轉(zhuǎn)化子。但對于分泌表達(dá)來說，外源基因的劑量固然是一個重要的因素，但蛋白的翻譯、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白折疊和加工、分泌途徑同樣會影響外源蛋白的表達(dá)，高劑量的外源基因的表達(dá)可能會對菌體本身的生長帶來不利影響，因此，對于釀酒酵母的分泌型表達(dá)，并不是拷貝數(shù)越多越好，需要篩選得到最優(yōu)拷貝數(shù)[32-33]。本研究利用rDNA整合法構(gòu)建了釀酒酵母木聚糖酶工程菌，通過ddPCR技術(shù)鑒定得到了10 種不同拷貝數(shù)的菌株，對這些菌株產(chǎn)木聚糖酶的能力進行測定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)拷貝數(shù)小于9時，木聚糖酶活力與拷貝數(shù)呈正相關(guān)，在9 拷貝時達(dá)到最高，為308 U/mL；當(dāng)拷貝數(shù)大于9時，木聚糖酶活力反而降低，到18 拷貝時，其產(chǎn)酶活力僅為9拷貝時的44%；對9 拷貝菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)其在傳代8 次后，仍能保持產(chǎn)酶穩(wěn)定，說明用rDNA整合法得到的木聚糖酶釀酒酵母能穩(wěn)定遺傳。

本實驗成功構(gòu)建木聚糖酶rDNA整合表達(dá)載體，并整合到釀酒酵母基因組獲得10 株不同拷貝數(shù)的菌株，對其酶活力進行測定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)拷貝數(shù)小于9時，產(chǎn)酶能力隨拷貝數(shù)增加而增強，9 拷貝菌株產(chǎn)酶能力最強，酶活力為308 U/mL，超過9 拷貝，產(chǎn)酶能力降低。

參考文獻：

[1]單志瓊, 周峻崗, 周宇飛, 等. 產(chǎn)堿性木聚糖酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 遺傳, 2012, 34(3): 356-365. DOI:10.3724/SP.J.1005.2012.00356.

[2]孫振濤, 趙祥穎, 劉建軍, 等. 微生物木聚糖酶及其應(yīng)用[J]. 生物技術(shù), 2007, 17(2): 93-97. DOI:10.3969/j.issn.1004-311X.2007.02.033.

[3]李杰, 張會, 張瑩瑩, 等. 食品級木聚糖酶黑曲霉工程菌的構(gòu)建[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2013, 44(11): 7-13. DOI:10.3969/j.issn.1005-9369.2013.11.002.

[4]LU Y, ZHONG H, TANG Q, et al. Construction and verification of CYP3A5 gene polymorphisms using a Saccharomyces cerevisiae expression system to predict drug metabolism[J]. Molecular Medicine Reports, 2017, 15(4): 1593-1600. DOI:10.3892/mmr.2017.6214.

[5]PAYNE T, HANFREY C, BISHOP A L, et al. Transcript-specific translational regulation in the unfolded protein response of Saccharomyces cerevisiae[J]. FEBS Letters, 2008, 582(4): 503-509.DOI:10.1016/j.febslet.2008.01.009.

[6]WANG H Y, XIAO D F, ZHOU C, et al. YLL056C, from Saccharomyces cerevisiae, encodes a novel protein with aldehyde reductase activity[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2017,101(11): 4507-4520. DOI:10.1007/s00253-017-8209-5.

[7]KWAN E X, WANG X S, AMEMIYA H M, et al. rDNA Copy number variants are frequent passenger mutations in Saccharomyces cerevisiae deletion collections and de novo transformants[J]. G3 (Bethesda),2016, 6(9): 2829-2838. DOI:10.1534/g3.116.030296.

[8]JAMES S A, WEST C, DAVEY R P, et al. Prevalence and dynamics of ribosomal DNA micro-heterogeneity are linked to population history in two contrasting yeast species[J]. Scientific Reports, 2016, 6: 28555.DOI:10.1038/srep28555.

[9]武志強, 賈耐兵, 李娜, 等. 酵母整合型載體的構(gòu)建及其功能分析[J]. 生物學(xué)通報, 2008, 43(5): 47-50. DOI:10.3969/j.issn.0006-3193.2008.05.020.

[10]程誠, 熊亮, 李勇昊, 等. 混合糖發(fā)酵重組釀酒酵母的菌株構(gòu)建和菊芋秸稈同步糖化發(fā)酵研究[J]. 微生物學(xué)通報, 2016, 43(7): 1411-1418. DOI:10.13344/j.microbiol.china.150576.

[11]周巍, 李月華, 孫勇, 等. 微滴式數(shù)字PCR技術(shù)定量檢測發(fā)酵乳中金黃色葡萄球菌[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 287-291. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716046.

[12]詹成, 燕麗, 王琳, 等. 數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用[J]. 復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版), 2015, 42(6): 786-789. DOI:10.3969/j.issn.1672-8467.2015.06.017.

[13]王杰, 王全, 田娜, 等. 不同植物組織RNA提取方法的比較分析[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報, 2015, 30(1): 76-80. DOI:10.13473/j.cnki.issn.1002-3186.2014.0093.

[14]周晨妍, 劉振華, 王丹丹, 等. 木聚糖酶Xyn43A基因在大腸桿菌及畢赤酵母中的表達(dá)比較[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(6): 15-19.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606003.

[15]唐天樂, 高炳淼, 長孫東亭, 等. 高質(zhì)量畢赤酵母基因組DNA提取方法比較[J]. 生物技術(shù)通報, 2010, 2010(1): 196-199. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2010.01.021.

[16]高麗麗, 王慶華, 梁會超, 等. 釀酒酵母羊毛甾醇合酶基因單倍體缺陷型突變株的構(gòu)建[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2014, 49(5): 742-746.DOI:10.16438/j.0513-4870.2014.05.001.

[17]GIETZ R D, WOODS R A. Yeast transformation by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method[J]. Methods in Molecular Biology, 2006,313: 107-120. DOI:10.1007/978-1-4939-1363-3_1.

[18]SRISUTHAM S, SARALAMBA N, MALLERET B, et al. Four human Plasmodium species quantification using droplet digital PCR[J]. PLoS ONE, 2017, 12(4): e0175771. DOI:10.1371/journal.pone.0175771.

[19]CAVALLI M, DE NOVI L A, DELLA S I, et al. Comparative analysis between RQ-PCR and digital droplet PCR of BCL2/IGH gene rearrangement in the peripheral blood and bone marrow of early stage follicular lymphoma[J]. British Journal of Haematology, 2017, 177(4):588. DOI:10.1111/bjh.14616.

[20]ARVIA R, SOLLAI M, PIERUCCI F, et al. Droplet digital PCR(ddPCR) vs quantitative real-time PCR (qPCR) approach for detection and quantification of Merkel cell polyomavirus (MCPyV) DNA in formalin fixed paraffin embedded (FFPE) cutaneous biopsies[J].Journal of Virological Methods, 2017, 246: 15-20. DOI:10.1016/j.jviromet.2017.04.003.

[21]SUZAWA K, YAMAMOTO H, OHASHI K, et al. Optimal method for quantitative detection of plasma EGFR T790M mutation using droplet digital PCR system[J]. Oncology Reports, 2017, 37(5): 3100-3106.DOI:10.3892/or.2017.5567.

[22]張居作, 徐君飛, 陳漢忠, 等. BE-91菌株木聚糖酶活力測定條件的優(yōu)化[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 49(4): 950-953. DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2010.04.003.

[23]史紅玲, 汪俊卿, 鄔敏辰, 等. 畢赤酵母產(chǎn)重組木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 中國生物制品學(xué)雜志, 2012, 25(10): 1362-1365. DOI:10.13200/j.cjb.2012.10.123.shihl.016.

[24]JIA P, PURCELL M K, PAN G, et al. Analytical validation of a reverse transcriptase droplet digital PCR (RT-ddPCR) for quantitative detection of infectious hematopoietic necrosis virus[J]. Journal of Virological Methods, 2017, 245: 73-80. DOI:10.1016/j.jviromet.2017.03.010.

[25]KLINE M C, DUEWER D L. Evaluating droplet digital PCR for the quantification of human genomic DNA: lifting the traceability fog[J].Analytical Chemistry, 2017, 89(8): 4648-4654. DOI:10.1021/acs.analchem.7b00240.

[26]姜羽, 胡佳瑩, 楊立桃. 利用微滴數(shù)字PCR分析轉(zhuǎn)基因生物外源基因拷貝數(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2014, 22(10): 1298-1305.DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2014.10.013.

[27]于曉帆, 高宏偉, 孫敏, 等. 熒光PCR和數(shù)字PCR法檢測轉(zhuǎn)基因DAS-44406-6品系大豆[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(16): 235-241. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201616038.

[28]BRUNETTI C, ANELLI L, ZAGARIA A, et al. Droplet digital PCR is a reliable tool for monitoring minimal residual disease in acute promyelocytic leukemia[J]. Journal of Molecular Diagnostics, 2017,19(3): 437-444. DOI:10.1016/j.jmoldx.2017.01.004.

[29]GITTINS J R, D’ANGELO C, OSWALD F, et al. Fluorescent protein-mediated colour polymorphism in reef corals: multicopy genes extend the adaptation/acclimatization potential to variable light environments[J]. Molecular Ecology, 2015, 24(2): 453-465.DOI:10.1111/mec.13041.

[30]黃貞杰, 陳玲, 張積森, 等. ScINO1基因克隆及酵母多基因多拷貝整合表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 福建師大學(xué)報(自然科學(xué)版), 2012, 28(6):100-105. DOI:10.3969/j.issn.1000-5277.2012.06.019.

[31]LIN X Q, LIANG S L, HAN S Y, et al. Quantitative iTRAQ LCMS/MS proteomics reveals the cellular response to heterologous protein overexpression and the regulation of HAC1 in Pichia pastoris[J]. Journal of Proteomics, 2013, 91: 58-72. DOI:10.1016/j.jprot.2013.06.031.

[32]MARX H, MECKLENBR?UKER A, GASSER B, et al. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus[J]. FEMS Yeast Research, 2009, 9(8): 1260-1270. DOI:10.1111/j.1567-1364.2009.00561.x.

[33]吳志偉, 徐立新, 佟金, 等. 多拷貝策略在增強目的基因表達(dá)中的應(yīng)用[J]. 生命科學(xué)研究, 2016, 20(2): 166-170. DOI:10.16605/j.cnki.1007-7847.2016.02.014.