劉志華 馬晨光

1(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(北京予求醫(yī)學(xué)研究院 北京 100022)

1 引 言

隨著人口老齡化的加劇，心血管疾病已經(jīng)成為威脅人類生命的“頭號(hào)殺手”。缺血性心肌病亦即冠心病，是一種常見的心血管疾病，是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起管腔狹窄，因此造成心肌供血供氧障礙而引起的心臟病。在臨床上，缺血性心肌病特別是急性期，病人的死亡率及存活病人心力衰竭的發(fā)病率仍然居高不下。缺血性心肌病嚴(yán)重危害著患者的身體健康，對(duì)患者乃至其家庭和社會(huì)的傷害很大。

一切組織、器官正常的機(jī)能、代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)的維持，必須有充分的、與代謝相適應(yīng)的血液灌注。如果血液灌流量絕對(duì)或相對(duì)不足，均可引起相應(yīng)組織、器官不同程度的機(jī)能、代謝紊亂和結(jié)構(gòu)損害，即缺血性損傷[1]。不同組織、器官對(duì)缺血的耐受性不同，甚至有相當(dāng)大的差異，但這種變化如果發(fā)生在重要器官(如心臟)，將會(huì)給機(jī)體帶來(lái)嚴(yán)重影響。心肌缺血性損傷(Myocardial Ischemic Injury)是由于多種原因引起的冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞而導(dǎo)致，以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化最常見[2]。

缺血導(dǎo)致心肌發(fā)生細(xì)胞水平的損傷及器官水平的功能障礙。目前國(guó)內(nèi)外的研究表明，缺血引起心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，表現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)增多、線粒體呼吸鏈?zhǔn)軗p[3,4]；同時(shí)也引起心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激出現(xiàn)[5,6]，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-9]及自噬[10,11]，嚴(yán)重時(shí)引起細(xì)胞壞死，即心肌梗死。缺血引起心肌組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)在炎細(xì)胞浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及 T 細(xì)胞等，同時(shí)炎細(xì)胞及心肌細(xì)胞釋放多種炎癥因子，包括 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1等[12,13]。這些病理學(xué)的改變使心肌細(xì)胞出現(xiàn)可逆或不可逆的損傷，對(duì)心功能造成極為不利的影響。

一直以來(lái)，缺血性心肌損傷的分子病理機(jī)制備受國(guó)際關(guān)注，國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多分子和信號(hào)通路參與了其中的發(fā)生、發(fā)展[14-19]。相關(guān)的機(jī)理涉及多種受體分子(如腺苷受體、α1受體、AngⅡ 受體和 M2受體等)[20]，各種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(如受體-抑制性 G 蛋白-腺苷環(huán)化酶系統(tǒng)、受體-磷脂酶 C-蛋白激酶 C 系統(tǒng)、NO-cGMP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng))[21,22]，多種信號(hào)通路(如MAPKs、AKT、NF-κB)[23,24]，同時(shí)還包括各種內(nèi)源性保護(hù)蛋白(如熱休克蛋白、金屬硫蛋白、氧自由基清除系統(tǒng))[25]。然而，缺血性心肌損傷是個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，這些被發(fā)現(xiàn)的分子并不能徹底地詮釋它的病理表現(xiàn)，其中的許多機(jī)制還有待探討。極低密度脂蛋白(Very Low Density Lipoprotein，VLDL)受體是低密度脂蛋白受體超基因家族的一員，能以高親和力結(jié)合含有 apoE的脂蛋白，是機(jī)體細(xì)胞攝取血液中富含甘油三脂的 VLDL 的主要受體，并與低密度脂蛋白受體在結(jié)構(gòu)上極其相似。這兩種受體均含有 5個(gè)功能域：(1)具有含半胱氨酸的數(shù)個(gè)重復(fù)序列；(2)EFG 同源域；(3)絲氨酸和蘇氨酸富集區(qū)，此區(qū)域是受體細(xì)胞外緊接胞膜的部分，被認(rèn)為是以 O－O 碳水化合物簇的部位；(4)跨膜部分；(5)胞內(nèi)域，含有一個(gè)包被陷窩的靶信號(hào)[26]。1992年，Lijima 等[27]成功地克隆了兔 VLDL 受體的 cDNA，闡明了其氨基酸序列及功能域，并基于對(duì)家兔內(nèi)各組織 VLDL 受體結(jié)構(gòu)及功能的研究成果，將 VLDL 受體分為兩型：Ⅰ 型為含有O-Link 糖鏈結(jié)合域，主要分布于骨骼肌、心肌、脂肪等組織中；Ⅱ 型則不含有糖鏈結(jié)合域，主要分布于脂肪、脾臟、腎臟等非肌組織中。Ⅰ 型受體比 Ⅱ 型受體難降解，結(jié)合 VLDL 的能力也更強(qiáng)。因此，推測(cè) Ⅰ 型 VLDL 受體在攝取甘油三酯中發(fā)揮了更大作用。

現(xiàn)階段存在的問(wèn)題是：國(guó)內(nèi)外研究并未充分闡明 VLDL 受體的生物學(xué)功能。多數(shù)研究注重于VLDL 受體與能量代謝、脂類代謝的關(guān)系，即便如此，VLDL 受體在能量代謝中的分子作用也未明確定義。關(guān)于 VLDL 受體的其他生物學(xué)功能研究很有限，而這些有限的研究卻表明 VLDL 受體不只是參與脂質(zhì)代謝那么簡(jiǎn)單，它在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、血管新生，甚至炎癥反應(yīng)[28-31]中發(fā)揮了調(diào)控作用。同時(shí)，關(guān)于 VLDL 受體發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理也有待明確。有研究表明，它對(duì)AKT 信號(hào)通路具有抑制作用[30]。VLDL 受體在心血管疾病中的作用更是少有研究，而且多局限在內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞[29,30]。但這些不多的研究卻提示 VLDL 受體與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[31]。關(guān)于 VLDL 受體在心肌病理?yè)p傷中的作用，目前僅檢索到 1篇發(fā)表在 Journal of Clinical Investigation 期刊上的成果。該文對(duì)VLDL 受體在心肌凋亡中的作用進(jìn)行研究，但關(guān)于心肌損傷的其他表型及其中的分子機(jī)理，文中并未深入探討[32]。本文結(jié)合生物信息學(xué)和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的方法和技術(shù)，通過(guò)開展實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，旨在研究并闡明 VLDL 受體對(duì)小鼠缺血性心肌損傷的影響及其中的分子機(jī)制。

2 實(shí)驗(yàn)方案

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括：野生型(Wild Type，WT)小鼠、極低密度脂蛋白受體基因敲除(VLDLR-KO)小鼠及心臟特異性轉(zhuǎn)基因(VLDLR-TG)小鼠。選擇體重在 24～26g、8周齡的雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，建立缺血性心肌損傷小鼠模型，進(jìn)行觀察和研究。

具體實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)(Sham)組和缺血(Ischemia)手術(shù)組兩組。其中，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組均包括 WT 小鼠、VLDLR-KO 小鼠及 VLDLR-TG 小鼠各 50只。

對(duì)于缺血(Ischemia)手術(shù)組，首先，小鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，左側(cè)胸部備皮，消毒手術(shù)區(qū)域，插管連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，沿第 3～4肋間水平切開皮膚，依次分離肌肉及軟組織，暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐與左心耳之間距主動(dòng)脈根部 1mm 處結(jié)扎前降支 30min，觀察縫線下方區(qū)域變白，局部心肌運(yùn)動(dòng)減弱。然后，逐層縫合胸壁，待恢復(fù)自主呼吸后拔出通氣導(dǎo)管。最后，待動(dòng)物清醒后送回飼養(yǎng)室，自由進(jìn)食和飲水。而假手術(shù)(Sham)組只在前降支處穿過(guò)一條短絲線，不作結(jié)扎，其他步驟同缺血(Ischemia)手術(shù)組(即模型組)。

無(wú)菌操作取出 1～3天乳鼠心臟，D-Hanks液沖洗，剪碎心室，用 0.06% II 型膠原酶和 25%胰酶分次消化，離心收集細(xì)胞后用含 15% 胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液懸浮分散細(xì)胞，接種于 100mm 培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2差時(shí)貼壁 1.5h。上清接種到明膠包被的 6孔板中，以α-actinin 染色鑒定心肌細(xì)胞純度。

取原代培養(yǎng)至第 4天的細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞 2～3次，然后換成無(wú)血清的培養(yǎng)基，并放至 37℃、5% CO2、95% N2密閉的缺氧裝置中培養(yǎng) 16h，以此體外模擬細(xì)胞缺血缺氧狀態(tài)。

2.2 缺血缺氧引起心肌損傷反應(yīng)指標(biāo)的檢測(cè)

基于已經(jīng)建成的缺血性心肌損傷小鼠模型和體外細(xì)胞缺血缺氧模型，對(duì)分組的動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，主要包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞壞死、凋亡和自噬的檢測(cè)。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)指標(biāo)，我們重點(diǎn)關(guān)注缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞的死亡途徑，包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死和自噬。具體檢測(cè)流程如下：

采用氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。具體地，用 Fe3＋還原法測(cè)定血漿 T-AOC，采用 Fenton 反應(yīng)及 Gress 顯色原理測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定丙二醛(MDA)含量，硝酸還原酶法測(cè)定一氧化氮(NO)。

應(yīng)用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)與蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)組織及細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子 GRP78、Chop、Atf6、Bip、XBP-1的表達(dá)水平；同時(shí)應(yīng)用 Western blot 檢測(cè)組織及細(xì)胞中 PERK 及 c-jun 的磷酸化水平。

2.2.1 炎癥反應(yīng)的檢測(cè)

(1)心肌組織炎癥反應(yīng)的檢測(cè)

①炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)：檢測(cè)缺血區(qū)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及 T 細(xì)胞的數(shù)量。各組心肌組織的冰凍切片用 Mac3、CD45、CD4、CD8及 7/4抗體進(jìn)行免疫組化染色，計(jì)數(shù)每組染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

②炎癥因子檢測(cè)：目前，心肌細(xì)胞代表性炎癥因子有 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1。通過(guò)提取組織總 RNA 和蛋白質(zhì)，應(yīng)用 Realtime PCR 與 Western blot 可測(cè)定這些炎癥因子的表達(dá)。

(2)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和 Real-time PCR 檢測(cè)培養(yǎng)上清及心肌細(xì)胞炎癥因子 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、MCP-1的表達(dá)。

2.2.2 細(xì)胞壞死、凋亡和自噬的檢測(cè)

采用 Roche 公司的 In situ Cell Death Detection(POD)試劑盒檢測(cè)各組凋亡細(xì)胞，同時(shí)采用 Western bolt 檢測(cè)凋亡相關(guān)分子 Bcl2、Bax、Bad、Bcl-xl、cIAP、FLIP 及 caspase8/cleaved caspase8、caspase9/cleaved caspase9、caspase3/cleaved caspase3等蛋白表達(dá)水平；采用PI(Propidium Iodide)染色檢測(cè)細(xì)胞的壞死；電鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的自噬體，同時(shí)用 Western bolt 檢測(cè) LC3Ⅱ、LC3Ⅰ 的表達(dá)水平。

3 結(jié)果與分析

3.1 VLDL 受體對(duì)缺血性心肌損傷的影響途徑研究

本文通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)研究 VLDL受體對(duì)缺血性心肌損傷的影響。

在體實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)采用 C57品系的野生型小鼠、VLDLR 基因敲除小鼠及心臟特異性 VLDLR轉(zhuǎn)基因小鼠(均以 C57為背景建立)，建立左冠狀動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的小鼠心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ停芯考偈中g(shù)組(Sham)與手術(shù)組(Ischemia)之間，以及野生型組與基因敲除組及轉(zhuǎn)基因組之間在心肌損傷方面的差異。

離體實(shí)驗(yàn)中，分離以上 3種乳鼠的心肌細(xì)胞，通過(guò)正常培養(yǎng)或缺血缺氧培養(yǎng)，以比較正常培養(yǎng)組與缺血缺氧培養(yǎng)組之間，以及野生型組與基因敲除組及轉(zhuǎn)基因組的心肌細(xì)胞之間在心肌損傷方面的差異。

具體指標(biāo)有：

(1)氧化應(yīng)激：測(cè)定血漿總抗氧化能力(T-AOC)，測(cè)定組織及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量。

(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：檢測(cè)組織及細(xì)胞中 PERK、Bip、XBP-1、Chop、Atf6及 c-jun 等的表達(dá)水平。

(3)炎癥：檢測(cè)心肌組織中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及 T 細(xì)胞的浸潤(rùn)；檢測(cè)組織及細(xì)胞中 IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1的表達(dá)。

(4)細(xì)胞壞死：測(cè)定血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)的水平；檢測(cè)心肌組織的壞死面積及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞壞死的程度。

(5)細(xì)胞凋亡：檢測(cè)在體及離體實(shí)驗(yàn)中凋亡細(xì)胞的數(shù)量；檢測(cè)組織及細(xì)胞中凋亡相關(guān)分子 Bcl2、Bax、Bad、Bcl-xl、cIAP、FLIP及 caspase8/cleaved caspase8、caspase9/cleaved caspase9、caspase3/cleaved caspase3等的表達(dá)。

(6)細(xì)胞自噬：檢測(cè)自噬體的形成及自噬相關(guān)分子 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ 的比值。

具體研究?jī)?nèi)容如下：

(1) 缺血缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞 VLDL 受體的表達(dá)

乳鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧培養(yǎng) 16h 后，采用Western blot 檢測(cè) VLDL 受體蛋白水平，結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果表明，缺血缺氧能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞 VLDL 受體的表達(dá)。

圖1 缺血缺氧引起心肌細(xì)胞 VLDL 受體(VLDLR)表達(dá)增強(qiáng)Fig.1Increased expression of VLDL receptor(VLDLR) in myocardial cells induced by ischemia and hypoxia

(2) VLDL 受體缺失保護(hù)缺血缺氧引起的心肌壞死和凋亡

在小鼠接受心肌 Ischemia 手術(shù)組中，術(shù)后3天分別采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色法檢測(cè)組織壞死程度、 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果表明，VLDL 受體缺失保護(hù)缺血缺氧引起的心肌壞死和凋亡。

圖2 VLDL 受體缺失保護(hù)缺血缺氧引起的心肌壞死和凋亡Fig.2VLDL receptor deletion protects against myocardial necrosis and apoptosis induced by ischemia and hypoxia

(3) VLDL 受體缺失抑制缺血缺氧引起的心肌組織 IL-1β 和 TNF-α 的表達(dá)

在小鼠接受心肌 Ischemia 手術(shù)組中，術(shù)后 3天采用免疫組化染色檢測(cè) CD3和 CD45陽(yáng)性細(xì)胞的組織侵潤(rùn)；乳鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧培養(yǎng) 16h 后用 ELISA 檢測(cè)培養(yǎng)上清液中 IL-1β 和 TNF-α 的水平，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，VLDL 受體缺失抑制缺血缺氧引起的心肌組織 IL-1β 和 TNF-α的表達(dá)。

圖3 VLDL 受體缺失抑制缺血缺氧引起的心肌組織炎癥反應(yīng)Fig.3VLDL receptor deletion inhibits infl ammation of myocardial tissue induced by ischemia and hypoxia

(4) VLDL 受體缺失抑制缺血缺氧引起的p-AKT 水平下調(diào)

乳鼠心肌細(xì)胞缺血缺氧培養(yǎng) 16h 后用Western blot 檢測(cè) p-AKT 蛋白水平，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，VLDL 受體缺失抑制缺血缺氧引起 p-AKT 水平下調(diào)。

圖4 VLDL 受體缺失緩解缺血缺氧引起的 p-AKT 水平下調(diào)Fig.4VLDL receptor deletion reduces p-AKT levels induced by ischemia and hypoxia

通過(guò)以上在體實(shí)驗(yàn)結(jié)合離體實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：缺血缺氧可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞 VLDL 受體的表達(dá)；而 VLDL 受體缺失不但可以保護(hù)缺血缺氧引起的心肌壞死和凋亡，還可以抑制缺血缺氧引起的心肌組織 IL-1β 和 TNF-α 的表達(dá)，及可以抑制缺血缺氧引起的 p-AKT 水平下調(diào)。

3.2 VLDL 受體影響缺血性心肌損傷的分子機(jī)制的討論

為了使本研究具有系統(tǒng)性和全面性，我們首先開展高通量芯片實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果開展生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。即生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合生物信息學(xué)分析的研究思路，通過(guò)構(gòu)建生物分子網(wǎng)絡(luò)探討 VLDL 受體影響缺血性心肌損傷的分子機(jī)制，包括關(guān)鍵分子與關(guān)鍵信號(hào)通路兩個(gè)方面。具體如下：

我們對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，消除背景噪音，去除同一實(shí)驗(yàn)的不同芯片之間的實(shí)驗(yàn)誤差。具體地，采用 RMA 算法進(jìn)行背景校正，采用 Quantile 算法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，采用 Pmonly 算法進(jìn)行 PM(Perfect Match)探針校正，采用 Medianpolish 算法進(jìn)行表達(dá)值的評(píng)估。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后采用 Limma 進(jìn)行差異表達(dá)分析，以 P＜0.01為篩選條件，篩選差異表達(dá)基因。選取 FDR(False Discovery Rate)＜0.05的差異表達(dá)基因，以蛋白互作數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)、翻譯后修飾數(shù)據(jù)、生物信號(hào)通路數(shù)據(jù)為背景信息，應(yīng)用Cytoscape 建立以 VLDL 受體為核心分子的生物分子網(wǎng)絡(luò)。

3.2.1 VLDL 受體發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵分子研究

生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子：本文采用高通量的基因芯片實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) VLDL 受體影響哪些基因的表達(dá)，即獲得心肌損傷情況下 VLDL受體影響的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)集。采用 Broad Institute of MIT and Harvard 開發(fā)的 GSEA 算法進(jìn)行分析。具體是以 GO(Gene Ontology)、TFT(Transcription Factor Targets)、KEGG、Biocarta 數(shù)據(jù)庫(kù)為信息背景，以 nominal P_value＜0.05為篩選條件，分別進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程(Biological Process)、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路的功能富集分析。

本文發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵分子的過(guò)程包括：(1)對(duì)差異表達(dá)基因以 GO 數(shù)據(jù)庫(kù)和 TFT 數(shù)據(jù)庫(kù)為分析背景，進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)屬于各生物學(xué)過(guò)程的重要分子及表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子；(2)以蛋白互作數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控?cái)?shù)據(jù)、翻譯后修飾數(shù)據(jù)為信息建立分子網(wǎng)絡(luò)，基于圖論原理(Graphic Theory)發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)潢P(guān)系及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子。分析生物網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，包括度(Degree)、聚類系數(shù)(Clustering Coefficient)、介數(shù)(Betweenness)、緊密度(Closeness)、同配性系數(shù)(Assortativity Coefficient)綜合評(píng)價(jià)分子節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用權(quán)重，發(fā)現(xiàn) VLDL 受體為網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵分子。

另外，本文還通過(guò)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了關(guān)鍵分子：檢測(cè)缺血缺氧狀態(tài)下，上述發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵分子分別在培養(yǎng)的 C57、VLDLR-KO及 VLDLR-TG 乳鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)水平，確定 VLDL 受體對(duì)上述發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵分子是否具有影響；同時(shí)，對(duì)關(guān)鍵分子也進(jìn)行基因敲除(如siRNA 轉(zhuǎn)染)或基因過(guò)表達(dá)(如腺病毒轉(zhuǎn)染)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)關(guān)鍵分子是否影響缺血性心肌損傷的各種病理表型(前部分提到的氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡、自噬等)；最后，綜合結(jié)果確定 VLDL 受體→分子→心肌損傷病理表型的因果關(guān)聯(lián)性。

3.2.2 VLDL 受體發(fā)揮生物學(xué)功能的關(guān)鍵信號(hào)通路研究

(1)基于芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵信號(hào)通路

基于生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵信號(hào)通路：以KEGG 和 Biocarta 數(shù)據(jù)庫(kù)為分析背景，對(duì)心肌損傷情況下 VLDL 受體影響的差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)集進(jìn)行功能富集分析，計(jì)算顯著被抑制及顯著被激活的信號(hào)通路。同時(shí)，檢測(cè)缺血缺氧狀態(tài)下，VLDL 受體是否對(duì)上述關(guān)鍵信號(hào)通路及其中的分子存在影響；另外對(duì)關(guān)鍵信號(hào)通路或其中的分子進(jìn)行抑制或激活，檢測(cè)關(guān)鍵信號(hào)通路是否影響缺血性心肌損傷的病理表型；最后，綜合結(jié)果分析VLDL 受體→信號(hào)通路→心肌損傷病理表型的因果關(guān)聯(lián)性。

(2)研究 VLDL 受體對(duì)常見的信號(hào)通路的影響

功能模塊是生物網(wǎng)絡(luò)中連接緊密的子網(wǎng)絡(luò)，其緊密度可以用模塊度(Modularity，Q)來(lái)衡量，它是該子網(wǎng)絡(luò)中已有的連接數(shù)與子網(wǎng)絡(luò)中可能的最大連接數(shù)的比值。計(jì)算公式為：

其中，m 為子網(wǎng)絡(luò)中已有的連接數(shù)；n 為子網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的個(gè)數(shù)。本文取 Q 值大于 0.6進(jìn)行功能模塊分析。

傳統(tǒng)以單個(gè)和少數(shù)幾個(gè)基因或蛋白的研究方法有很大的局限性。本文采用生物網(wǎng)絡(luò)的功能模塊計(jì)算分析，從整體水平上進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了 MAPKs(ERK、p38、JNK)、AKT、NF-κB 信號(hào)通路在缺血性心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，VLDL 受體抑制 AKT 信號(hào)通路，然而關(guān)于它對(duì) AKT 及其他信號(hào)通路在心肌組織中的影響未見研究。本文檢測(cè)了缺血缺氧狀態(tài)下，VLDL 受體是否影響這些信號(hào)通路；同時(shí)，對(duì)MAPKs、AKT、NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行抑制或激活，檢測(cè)它們是否影響缺血性心肌損傷的病理表型；最后，綜合各種結(jié)果分析并明確了 VLDL 受體→MAPKs、AKT、NF-κB 信號(hào)通路→心肌損傷病理表型的因果關(guān)聯(lián)性。

4 結(jié) 論

本文應(yīng)用 C57BL/6品系的野生型小鼠、VLDL 受體基因敲除小鼠和心臟特異性轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)在體與離體實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了 VLDL 受體對(duì)小鼠缺血性心肌損傷的影響。另外，檢測(cè)了缺血缺氧狀態(tài)下，VLDL 受體對(duì)這些信號(hào)通路的影響；同時(shí)，對(duì) MAPKs、AKT、NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)行抑制或激活，觀察它們對(duì)缺血性心肌損傷的病理表型的影響；最后，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析并明確了 VLDL 受體→MAPKs、AKT、NF-κB 信號(hào)通路→心肌損傷病理表型的因果關(guān)聯(lián)性，闡明了VLDL 受體影響缺血性心肌損傷的分子機(jī)制。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]Cheung JY,Bonventre JV,Malis CD,et al.Calcium and ischemic injury [J].The New England Journal of Medicine,1986,314(26): 1670-1676.

[2]Kim ES,Sun JK,Park N,et al.Purpose in life and reduced risk of myocardial infarction among older U.S.adults with coronary heart disease: a twoyear follow-up [J].Journal of Behavioral Medicine,2012,36(2): 124-133.

[3]Dreier JP,Drenckhahn C,Woitzik J,et al.Spreading ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage [J].Acta Neurochirurgica Supplement,2013,115: 125-129.

[4]Iadecola C,Ross ME.Molecular pathology of cerebral ischemia: delayed gene expression and strategies for neuroprotection [J].Annals of the New York Academy of Sciences,1997,835: 203-217.

[5]Osada N,Kosuge Y,Ishige K,et al.Characterization of neuronal and astroglial responses to ER stress in the hippocampal CA1area in mice following transient forebrain ischemia [J].Neurochemistry International,2010,57(1): 1-7.

[6]Vekich JA,Belmont PJ,Thuerauf DJ,et al.Protein disulfide isomerase-associated 6is an ATF6-inducible ER stress response protein that protects cardiac myocytes from ischemia/reperfusionmediated cell death [J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology,2012,53(2): 259-267.

[7]Fujita K,Yoshimoto N,Kato T,et al.Lycopene inhibits ischemia/reperfusion-induced neuronal apoptosis in gerbil hippocampal tissue [J].Neurochemical Research,2013,38(3): 461-469.

[8]Cheon SY,Cho KJ,Lee JE,et al.Cerebroprotective effects of red ginseng extract pretreatment against ischemia-induced oxidative stress and apoptosis[J].International Journal of Neuroscience,2013,123(4): 269-277.

[9]Ding ZM,Wu B,Zhang WQ,et al.Neuroprotective effects of ischemic preconditioning and postconditioning on global brain ischemia in rats through the same effect on inhibition of apoptosis[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(5): 6089-6101.

[10]Xu F,Li J,Ni W,et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor-gamma agonist 15d-prostaglandin J2mediates neuronal autophagy after cerebral ischemia-reperfusion injury [J].PLoS One,2013,8(1): e55080.

[11]Ma X,Liu H,Foyil SR,et al.Autophagy is impaired in cardiac ischemia-reperfusion injury [J].Autophagy,2012,8(9): 1394-1396.

[12]Guzzardi MA,Iozzo P.Fatty heart,cardiac damage,and inflammation [J].The Review of Diabetic Studies,2011,8(3): 403-417.

[13]Gruson D,Ahn SA,Rousseau MF.Biomarkers of infl ammation and cardiac remodeling: the quest of relevant companions for the risk stratification of heart failure patients is still ongoing [J].Biochemia Medica,2011,21(3): 254-263.

[14]劉志華,馬晨光.缺血性心肌病不同階段基因表達(dá)的改變模式研究 [J].集成技術(shù),20176(5): 69-75.

[15]Li Y,Jiang Q,Ding Z,et al.Identification of a common different gene expression signature in ischemic cardiomyopathy [J].Genes,2018,9(1):56.

[16]Liu ZH,Yang D,Xie P,et al.MiR-106b and MiR-15b modulate apoptosis and angiogenesis in myocardial infarction [J].Cellular Physiology and Biochemistry,2012,29(5-6): 851-862.

[17]Ren GM,Liu ZH.NetCAD: a network analysis tool for coronary artery disease associated PPI network[J].Bioinformatics,2013,29(2): 279-280.

[18]Cheng JK,Cao FL,Liu ZH.AGP: a multimethods web server for alignment-free genome phylogeny[J].Molecular Biology and Evolution,2013,30(5):1032-1037.

[19]Yang D,Xie P,Liu ZH.Ischemia/reperfusioninduced MKP-3impairs endothelial NO formation via inactivation of ERK1/2pathway [J].PLoS One,2012,7(7): e42076.

[20]Izmirly PM,Buyon JP,Saxena A.Neonatal lupus: advances in understanding pathogenesis and identifying treatments of cardiac disease [J].Current Opinion in Rheumatology,2012,24(5):466-472.

[21]Schluter KD,Wenzel S.Angiotensin II: a hormone involved in and contributing to pro-hypertrophic cardiac networks and target of anti-hypertrophic cross-talks [J].Pharmacology & Therapeutics,2008,119(3): 311-325.

[22]Booz GW.Putting the brakes on cardiac hypertrophy: exploiting the NO-cGMP counterregulatory system [J].Hypertension,2005,45(3):341-346.

[23]Burgoyne JR,Mongue-Din H,Eaton P,et al.Redox signaling in cardiac physiology and pathology [J].Circulation Research,2012,111(8): 1091-1106.

[24]Stahl GL,Shernan SK,Smith PK,et al.Complement activation and cardiac surgery: a novel target for improving outcomes [J].Anesthesia &Analgesia,2012,115(4): 759-771.

[25]Willis MS,Patterson C.Hold me tight: role of the heat shock protein family of chaperones in cardiac disease [J].Circulation,2010,122(17): 1740-1751.[26]Takahashi S,Sakai J,Fujino T,et al.The very low-density lipoprotein(VLDL) receptor:characterization and functions as a peripheral lipoprotein receptor [J].Journal of Atherosclerosis and Thrombosis,2004,11(4): 200-208.

[27]Lijima H,Miyazawa M,Sakai J,et al.Expression and characterization of a very low density lipoprotein receptor variant lacking the O-link sugar region generated by alternative splicing [J].The Journal of Biochemistry,1998,124(4): 747-755.

[28]Liu ZG,Li H,Li YH,et al.Up-regulation of VLDL receptor expression and its signaling pathway induced by VLDL and β-VLDL [J].Journal of Huazhong University of Science and Technology[Medical Sciences],2009,29(1): 1-7.

[29]Jiang A,Hu W,Meng H,et al.Loss of VLDL receptor activates retinal vascular endothelial cells and promotes angiogenesis [J].Investigative Ophthalmology & Visual Science,2009,50(2):844-850.

[30]Oganesian A,Armstrong LC,Migliorini MM,et al.Thrombospondins use the VLDL receptor and a nonapoptotic pathway to inhibit cell division in microvascular endothelial cells [J].Molecular Biology of the Cell,2008,19(2): 563-571.

[31]Perman JC,Bostr?m P,Lindbom M,et al.The VLDL receptor promotes lipotoxicity and increases mortality in mice following an acute myocardial infarction [J].The Journal of Clinical Investigation,2011,121(7): 2625-2640.

[32]Imagawa M,Takahashi S,Zenimaru Y,et al.Comparative reactivity of remnant-like lipoprotein particles(RLP) and low-density lipoprotein(LDL)to LDL receptor and VLDL receptor: effect of a high-dose statin on VLDL receptor expression [J].Clinica Chimica Acta,2012,413(3-4): 441-447.