葛以躍 譚焰 陳晨 吳濤 朱小娟 趙康辰 王麗 谷偉 崔侖標(biāo)

210009南京,衛(wèi)生部腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省疾病預(yù)防控制中心(葛以躍、吳濤、朱小娟、趙康辰、崔侖標(biāo))；210006南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院呼吸科(譚焰、陳晨、王麗、谷偉)

流感病毒分為甲、乙、丙3種類型,其中甲型流感病毒的宿主最為廣泛,其抗原變異率也最高,容易引起大流行。2009年初,一種新型甲型H1N1流感病毒(pandemic H1N1/09 virus)首先在墨西哥發(fā)現(xiàn),而后在全球不斷蔓延[1],目前已成為季節(jié)性流感病毒的一部分,嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。

老年人的各個(gè)器官生理功能逐步下降,如同時(shí)伴有慢性基礎(chǔ)性疾病,則更容易感染流感病毒,而且很容易發(fā)展為肺炎.研究表明,肺炎是流感患者病情加重和死亡的重要原因[3]。國家流感中心流感監(jiān)測結(jié)果顯示,自2017年底至2018年初,我國流感發(fā)病率較往年同期明顯升高,以甲型H1N1流感和乙型流感的流行為主,伴隨著部分甲型H3N2流感的流行。與往年相比,乙型流感病毒的Yamagata型顯著增多,使得現(xiàn)有三價(jià)疫苗對該病毒亞型失去預(yù)防作用。對于此次流行的甲型H1N1流感病毒,尚未見病原學(xué)特征顯著改變的相關(guān)報(bào)道,進(jìn)一步研究其病原分子特征對于疾病的預(yù)防和診治具有重要意義。本研究對南京市第一醫(yī)院呼吸科2018年1～3月份收治的,確診為甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者的臨床資料和流感病毒病原學(xué)進(jìn)行分析,探討老年人甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點(diǎn)及本流行季的病毒分子特征,為老年流感的防治提供依據(jù),提高臨床診治效果。

1 材料與方法

1.1 研究對象在2018年1～3月份期間,收集在南京市第一醫(yī)院呼吸科住院的有流感樣癥狀的老年(≥60歲)肺炎患者40例,最終確診為甲型H1N1流感病毒感染者共17例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)出現(xiàn)過流感樣癥狀；(2)病程中經(jīng)胸部CT或胸片檢查證實(shí)肺炎存在；(3)患者痰標(biāo)本或鼻咽拭子標(biāo)本甲型H1N1流感病毒核酸檢測陽性。病例的臨床資料采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)采集表進(jìn)行收集。本研究獲得南京第一醫(yī)院倫理委員會審查通過,標(biāo)本采集獲得患者或家屬知情同意。

1.2 儀器與試劑全自動核酸提取儀及其配套試劑(EX-DNA/RNA病毒)購自西安天隆科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7900HT)購自美國Life Technologies公司；PrimeScrip RT reagent Kit(Perfect Real Time)、PrimeScript Reverse Transcriptase和 LA Taq購自日本 TaKaRa公司；Nextera XT Library Preparation Kit和MiSeq Reagent Kit v3(600 cycles)購自美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與病毒核酸檢測：采集目標(biāo)患者的痰標(biāo)本或鼻咽拭子標(biāo)本,-80℃冰箱保存。參照全自動核酸提取儀和病毒核酸提取試劑盒使用說明書提取病毒總核酸。采用One Step PrimeScrip RTPCR Kit通過Real-time RT-PCR法[4-5]檢測甲型流感病毒及其亞型(季節(jié)性H3N2和甲型H1N1流感病毒)。同時(shí)采用Real-time PCR/RT-PCR法對每一份樣本的28種常見呼吸道病原進(jìn)行檢測,觀察是否存在合并感染。

1.3.2 病毒全基因組擴(kuò)增和高通量測序：采用Primescript Reverse Transcriptase和甲型流感病毒8節(jié)段通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),制備的cDNA進(jìn)一步采用LA Taq和一對甲型流感病毒通用引物擴(kuò)增流感病毒全基因組,純化并回收PCR產(chǎn)物。采用Qubit 2.0熒光劑對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量,而后作為模板制備測序文庫,具體操作按Nextera XT Library Preparation Kit說明書進(jìn)行。將制備好的文庫加入MiSeq測序樣品孔,按2×300 bp進(jìn)行末端配對測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)分析測序產(chǎn)生的fastq原始數(shù)據(jù)采用生物信息學(xué)綜合分析工具CLC Genomic Workbench 7.5.1進(jìn)行處理和分析。從全球流感共享數(shù)據(jù)庫(GISAID)下載甲型H1N1流感病毒參考序列,采用MEGA 6.0軟件對病毒進(jìn)化進(jìn)行分析,通過鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,重復(fù)抽樣1 000次(Bootstrap=1 000)對進(jìn)化樹進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)通過對氨基酸序列比對進(jìn)一步分析病毒的抗原位點(diǎn)、毒力位點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)的變異情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料采用±s表示,計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比來表示,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的一般資料在有流感樣癥狀的40例老年(≥60歲)肺炎患者中,通過病毒核酸檢測,最終確診為甲型H1N1流感病毒感染的共有17例。如表1所示：在17例甲型H1N1流感患者中,7例存在合并感染,比例達(dá)41.2%,其中合并單純皰疹病毒感染2例,合并鼻病毒、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和EB病毒感染的各1例?；颊咂骄挲g為73.8±10.8歲,9例≥75歲(52.9%),其中男性占總例數(shù)的57.9%。重癥與危重癥病例的比例為0.89∶1。所有患者至少合并1種基礎(chǔ)性疾病,慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)、高血壓和腦血管病是最為常見的基礎(chǔ)病,合并比例分別為52.9%、52.9%和35.3%。存在1種以上基礎(chǔ)病的患者比例達(dá)70.1%,存在重要基礎(chǔ)性疾病(冠心病、充血性心力衰竭、慢性腎功能不全、惡性腫瘤、肝硬化和免疫抑制)的比例為41.2%。在本組老年人群中,流感疫苗的接種率為0%。

表1 患者一般資料和基礎(chǔ)性疾病合并情況Tab.1 General information and the existence of underlying diseases of the patients

2.2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床特征和實(shí)驗(yàn)室檢查在甲型H1N1流感病毒性肺炎的老年患者中,呼吸系統(tǒng)癥狀和發(fā)熱是最為主要的臨床表現(xiàn)。88.2%的患者存在發(fā)熱,最高體溫為38.38±0.84℃,其中高熱(≥39℃)患者所占比例為41.2%?？人?、咽痛、呼吸困難的比例分別為100%、11.8%和76.5%。23.5%的患者同時(shí)伴有消化道癥狀。患者的白細(xì)胞計(jì)數(shù)為(6.25±2.77)×109/L,以正常和降低為主。47.1%的患者伴有低鈉血癥,其中2例(11.8%)屬于重度(＜125 mmol/L)。部分患者伴有肝功能異常,谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素異常的比例分別為11.8%、17.6%和11.8%。94.1%的患者均伴有乳酸脫氫酶的增高。胸部影像表現(xiàn)為雙肺病變的比例為76.5%,其中危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.3 氨基酸位點(diǎn)分析

2.3.1 抗原位點(diǎn)和宿主特異性位點(diǎn)：與疫苗株相比,所測毒株HA蛋白10處氨基酸變異中有9處發(fā)生在HA1上,其中3處發(fā)生在抗原位點(diǎn)上(Ca、Cb和Sa各1個(gè)),分別為H138Y、S74R和S164T,具體變異情況見表3。受體結(jié)合位點(diǎn)(Receptor-binding site,RBS)是流感病毒宿主特異性的一個(gè)重要決定因素,本研究所有毒株的HA蛋白未發(fā)生RBS的氨基酸變異。除了RBS外,PB2中的一些位點(diǎn)在宿主特異性中也發(fā)揮重要作用,通過比較發(fā)現(xiàn),所測毒株P(guān)B2蛋白的宿主特異性位點(diǎn)均與疫苗株相同,為590S、591R、627E、701D 和714S。

2.3.2 潛在糖基化位點(diǎn)：疫苗株A/Michigan/45/2015的HA蛋白有9個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)(10NNST、11NST、23NVT、87NGT、162NQS、276NTT、287NTS、481NGT和540NGS),除了A/Nanjing/2018031/2018的潛在糖基化位點(diǎn)與疫苗株完全相同外,其余8株病毒HA蛋白的162位均為162NQT,但同樣為N-糖基化位點(diǎn)的保守序列模式,所以未發(fā)生潛在糖基化位點(diǎn)數(shù)量上的增減。

2.3.3 毒力位點(diǎn)和耐藥位點(diǎn)：與疫苗株相同,所有毒株的HA裂解位點(diǎn)均為為PSIQSR↓GLFGA,只含有一個(gè)堿性氨基酸,為非高致病力特征。除了HA裂解位點(diǎn)外,流感病毒的毒力位點(diǎn)分布于多個(gè)節(jié)段上。通過分析發(fā)現(xiàn),所測毒株的相關(guān)毒力位點(diǎn)特征為：222D(HA,H1 numbering)、139T(M1)、215 A(M1)、42S(NS1)、92D(NS1)、36 A(PA)、353 K(PA)、99H(PB1)、368I(PB1)、89 V(PB2)和 357H(PB2),與疫苗株保持一致,未發(fā)生毒力改變。在耐藥方面,A/Nanjing/2018029/2018毒株的NA發(fā)生了H275Y(N1 numbering)變異,提示可能對流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑類藥物耐藥。

表2 老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者的臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查Tab.2 Clinical features and laboratory examination of the influenza A(H1N1)viral pneumonia in the elderly

表3 甲型H1N1病毒HA蛋白氨基酸位點(diǎn)變異情況Tab.3 Variation of HA amino acid sites of the influenza A(H1N1)viruses

2.4 甲型H1N1流感病毒HA基因進(jìn)化分析在17例甲型H1N1流感標(biāo)本中,共有9例測序獲得了病毒全基因組序列,所有毒株的8個(gè)基因節(jié)段平均測序深度為140×～47098×。HA基因進(jìn)化分析結(jié)果表明,與疫苗株A/Michigan/45/2015相似,本研究所有毒株的HA基因均屬于甲型H1N1病毒6B組6B.1亞組,以S84 N、S162 N和I216T氨基酸替換為特征。此外,本研究所有毒株還發(fā)生了S74R和I295 V氨基酸變異。除了A/Nanjing/2018031/2018之外,所有毒株還發(fā)生了S164T變異。各毒株之間的HA核苷酸同源性為98.1% ～100%,氨基酸同源性為97.7%～100%。所測毒株HA核苷酸與疫苗株的同源性為97.8% ～98.9%,氨基酸同源性為97.5%～99.6%。HA基因進(jìn)化分析情況詳見圖1。

注：▲本次測序毒株；●WHO推薦疫苗株圖1 甲型H1N1流感病毒HA基因系統(tǒng)發(fā)生樹Note： ▲Strains sequenced in this study；●WHO recommended vaccine strainsFig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of influenza A(H1N1)viruses

3 討論

流感病毒是引起老年肺炎的主要病毒之一,研究表明,對于甲型H1N1流感而言,老年病例的病死率顯著高于其他年齡段[6]。因此,了解老年甲型H1N1流感病毒性肺炎的臨床特點(diǎn),進(jìn)一步分析其在南京地區(qū)老年人中的分子特征,對于臨床診斷、疾病預(yù)防、針對性用藥以及避免濫用抗生素均具有重要意義。

劉曉偉等[7]分析了86例以青壯年為主的甲型H1Nl流感病毒性肺炎患者的臨床資料,只有15.1%的患者存在基礎(chǔ)疾病。本研究發(fā)現(xiàn),所有入選的老年患者至少合并有1種基礎(chǔ)性疾病,存在1種或以上嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病的患者比例達(dá)41.2%。高齡和基礎(chǔ)病的存在直接影響到甲型流感的嚴(yán)重程度和預(yù)后,增加了臨床治療的難度[8]?！吨袊宰枞苑渭膊≡\治指南(2013年修訂版)》指出,使用流感疫苗可以減少COPD患者的嚴(yán)重程度和死亡率,說明COPD患者很容易發(fā)生流感感染并導(dǎo)致死亡,在本研究中,老年流感肺炎患者的COPD合并比例高達(dá)52.9%,然而流感疫苗的接種率卻為0%,所以,老年COPD患者更應(yīng)該定期接種流感疫苗以預(yù)防感染。通過對臨床表現(xiàn)分析發(fā)現(xiàn),發(fā)熱和呼吸系統(tǒng)癥狀最為突出,與已有報(bào)道一致[8]。23.5%的患者伴有消化道癥狀,低于美國所報(bào)道的比例[9],但高于國內(nèi)報(bào)道的比例[10]。在實(shí)驗(yàn)室檢查方面,超過90%的患者出現(xiàn)乳酸脫氫酶增高,可能與肺臟和心肌的損害有關(guān)。胸部影像表現(xiàn)以雙肺病變?yōu)橹?與以往報(bào)道一致[11],危重癥患者雙肺病變的比例高于重癥患者,然而差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究的樣本量較小,部分結(jié)論還需要進(jìn)行大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

二代測序技術(shù)在流感病毒的鑒定及全基因組序列分析方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢[12],與WHO推薦疫苗株A/Michigan/45/2015相同,本研究所測病毒的HA基因均屬于甲型H1N1病毒的6B組6B.1亞組?？乖稽c(diǎn)的變異直接影響到流感病毒的抗原漂移,與疫苗株相比,本研究所測病毒的HA蛋白發(fā)生了10處氨基酸變異,有3處發(fā)生在抗原位點(diǎn)上,分別為Ca抗原的H138Y變異、Cb抗原的S74R變異和Sa抗原的S164T變異,這些變異是否會影響到疫苗株的保護(hù)效果還有待進(jìn)一步研究。糖基化位點(diǎn)的主要作用是穩(wěn)定HA結(jié)構(gòu),防止HA水解的同時(shí)還可以阻礙抗體的識別,本研究中雖然大部分病毒發(fā)生了162NQS到162NQT的改變,但糖基化位點(diǎn)的數(shù)量并未發(fā)生增減。由于甲型H1N1病毒對烷胺類抗病毒藥物普遍耐藥,所以病毒是否發(fā)生對NA抑制劑的耐藥尤為重要,A/Nanjing/2018029/2018毒株發(fā)生了H275Y變異,提示可能對流感病毒NA抑制劑類藥物耐藥從而影響治療效果,臨床資料顯示,在治療過程中,該患者的最高體溫達(dá)40度,在所有患者中最高,乳酸脫氫酶的水平達(dá)1 000 U/L,C反應(yīng)蛋白達(dá)122 mg/L,而且發(fā)生了呼吸衰竭,為危重癥病例,推測可能與NA抑制劑的治療效果不佳有一定關(guān)系。

雖然目前甲型H1N1流感未發(fā)生再次大流行,但是對于老年人特別是未接種流感疫苗者,很容易發(fā)生流感并發(fā)展為肺炎,預(yù)后較差。老年甲型H1N1流感病毒性肺炎患者多合并基礎(chǔ)疾病,容易產(chǎn)生合并感染,臨床工作者在診治過程中需要密切關(guān)注這些特點(diǎn)。隨著群體免疫壓力和抗病毒藥物壓力的選擇,甲型H1N1病毒可能在今后出現(xiàn)新的變異導(dǎo)致其抗原性和耐藥性發(fā)生變化,需要對病毒的分子特征持續(xù)監(jiān)測,為疾病預(yù)防和臨床抗病毒治療提供依據(jù)。

利益沖突無