胡泠影 張圓圓 曾峰 華清泉

內(nèi)耳細(xì)胞的過(guò)氧化損傷與多類(lèi)神經(jīng)性聾有關(guān)[1，2]。研究表明血管紋邊緣細(xì)胞(marginal strial cell，MC)很容易受到過(guò)氧化損害，MC在維持耳蝸內(nèi)高鉀狀態(tài)、淋巴高滲透壓、耳蝸內(nèi)高電位等特殊電生理特征方面有重要意義，是維持耳蝸毛細(xì)胞生理功能的必要條件[3，4]。過(guò)氧化損傷通常由活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起，細(xì)胞內(nèi)ROS增多時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死或組織功能的損害[5，6]。目前氧化應(yīng)激模型多采用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GO)法，GO可模擬氧化環(huán)境，使細(xì)胞穩(wěn)定產(chǎn)生H2O2[7～9]。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了體外培育MC的一系列方法，本研究擬采用GO處理體外培育的MC來(lái)建立大鼠耳蝸MC的過(guò)氧化損傷模型，并評(píng)價(jià)該模型的穩(wěn)定性和可靠性，為進(jìn)一步探究MC氧化損傷的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1大鼠耳蝸MC的提取及培養(yǎng) 取3日齡以內(nèi)的SD幼鼠(42只，每次用4～8只，分7次完成，分別用于以下實(shí)驗(yàn))耳蝸，用75%酒精浸泡10分鐘后，去除幼鼠雙側(cè)顳骨，在顯微鏡下從耳蝸?lái)敳恐恋撞恐饘咏馄史蛛x得到血管紋細(xì)胞。將所得組織剪碎至約0.5 mm后用II型膠原酶在37 ℃恒溫箱中消化30分鐘，隨后800～1 000 rpm離心機(jī)離心5分鐘；去除上清液，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中(EpiCM，Scien Cell, USA)置于5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)待用[10]。

1.2大鼠MC的鑒定 提取培養(yǎng)的MC用角蛋白-18(CK18)作為標(biāo)記物通過(guò)免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定[10]。將所提取的MC接種至多聚賴氨酸(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)處理過(guò)的蓋玻片上，置于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制作細(xì)胞爬片，待MC爬片形成單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)后，棄掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，用4%的多聚甲醛在室溫下固定15分鐘，隨后再用PBS清洗3次；用0.3% TritonX-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)將MC破膜處理20分鐘，然后用PBS清洗三次；5%的血清白蛋白(BSA)封閉20分鐘后，用CK18抗體(1∶50，Abcam，Cambridge, MA, USA)在4 ℃下孵育過(guò)夜，隨后用抗兔的IgG二抗(1∶100)在室溫下孵育30分鐘，然后用PBS清洗三次。洗滌MC并用4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma-Aldrich，St. Louis, MO,USA)在室溫下染色3分鐘后，在熒光顯微鏡下觀察并鑒定。

1.3CCK8法檢測(cè)GO對(duì)MC損傷的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值 用CCK8法(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)檢測(cè)細(xì)胞活性，以獲得GO對(duì)MC損傷的IC50值。將MC接種于96孔板中，待細(xì)胞形成單層結(jié)構(gòu)而且細(xì)胞融合度約為90%時(shí)，每孔加入0、1、2、4、8、16、32、64 mU/ml的GO，每個(gè)濃度制作3個(gè)復(fù)孔，處理24小時(shí)；隨后每孔加入20 μl的CCK8工作液，37 ℃孵育1.5小時(shí)后，450 nm下酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的吸光度值(OD值)。以不含細(xì)胞的孔為調(diào)零組，GO濃度為0 mU/ml的孔為空白組，其余組為濃度梯度組，各組細(xì)胞活性%=(各濃度梯度組OD值-調(diào)零組OD值)/(空白組OD值-調(diào)零組OD值)×100%，制作GO對(duì)MC凋亡作用的濃度依賴曲線，據(jù)此得出GO對(duì)MC損傷的IC50值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)及熒光顯微鏡檢測(cè)原代MC內(nèi)ROS的表達(dá) 細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平用熒光分子探針DCFH-DA(Beyotime, Shanghai, China)檢測(cè)，將MC接種于6孔板內(nèi)，分為以下兩組：用GO處理的MC作為實(shí)驗(yàn)組，處理時(shí)間為24小時(shí)，GO濃度采用1.3中所測(cè)算的IC50值；以不加GO處理的MC作為對(duì)照組，處理時(shí)間同實(shí)驗(yàn)組；然后，用DCFH-DA(10 μM)室溫下孵育30分鐘后，用流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)兩組ROS的表達(dá)。

1.5超氧化化物歧化酶(SOD)活性的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)生的超氧化物歧化酶活性通過(guò)WST試劑盒檢測(cè)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,USA)，高水溶性的四唑鹽WST-1被樣品中的O2-氧化生成甲臜，其濃度與SOD活性成正比，然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)樣品吸光度。SOD標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度范圍是0.001～200 Units/ml，樣品的蛋白濃度用BCA法測(cè)定，單位為mg/ml，SOD的相對(duì)活性的單位為Units/mg。

1.6Western-blot檢測(cè)MC的凋亡蛋白 提取原代MC之后，將其均勻接種至6孔板中(細(xì)胞數(shù)量3.0×105個(gè)/孔)，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MC分別處理24小時(shí)后，每孔加入含有1 mM的phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)RIPA裂解液100 μl，在4 ℃下處理30分鐘，BCA法測(cè)定聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)和凋亡蛋白cleaved-caspase 3的蛋白濃度。用12%的SDS-page緩沖液電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜，用抗PARP1，cleaved-caspase-3，β-actin (Cell Signaling Technology, MA, USA)等抗體4 ℃下孵育過(guò)夜?；瘜W(xué)偶聯(lián)二抗室溫下孵育1小時(shí)后檢查印記的發(fā)光值，用Image Lab軟件分析灰度值，用β-actin灰度值(DPI)作為基準(zhǔn)量。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用Annexin V-FITC和propidium iodide (PI)雙標(biāo)進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別處理24小時(shí)之后，用PBS清洗3次，胰蛋白酶消化至約80%的細(xì)胞發(fā)生皺縮后終止消化，離心機(jī)1 000 rpm離心5分鐘后棄掉懸液，用PBS清洗2次，用包含有5 μlAnnexin V-FITC和5μlPI的100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸MC，室溫避光孵育15分鐘，隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD Biosciences, Carlsbad, CA)細(xì)胞凋亡情況。

1.8熒光試劑盒檢測(cè)MC凋亡 用熒光試劑盒Hoechst/PI檢測(cè)GO處理后細(xì)胞的凋亡。將MC接種于多聚賴氨酸預(yù)處理過(guò)的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞分散形成單層結(jié)構(gòu)后，加入Hoechst33258溶液，使其終濃度為1 mg/ml，在37 ℃下處理7分鐘。PBS清洗后，加入PI染液，使其終濃度為5 mg/ml,冰浴處理，PBS清洗之后，將培養(yǎng)板置于倒置熒光顯微鏡下(LSCM)觀察，記錄400～500 nm下的藍(lán)光和紅光，其中藍(lán)光標(biāo)記Hoechst，紅光標(biāo)記PI。用Corel Draw X5(Corel, Canada)軟件獲取圖像。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 (IBM, USA)統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，Western-blot結(jié)果采用Image Lab軟件(NIH，USA)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的對(duì)比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1原代MC的培養(yǎng)與鑒定 大鼠MC呈多邊形，有明顯的邊界,細(xì)胞之間緊密連接形成單層鋪路石樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光中CK8染色為強(qiáng)陽(yáng)性(圖1)。

2.2GO對(duì)MC活性的影響 用梯度濃度的GO處理MC 24小時(shí)后，MC出現(xiàn)不同比例的凋亡，GO對(duì)MC損傷的濃度依賴曲線見(jiàn)圖2，算得IC50=32.9 mU/ml [18.93，57.24]。

2.3實(shí)驗(yàn)組MC中ROS和SOD濃度 流式細(xì)胞學(xué)及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組MC內(nèi)ROS產(chǎn)生量較對(duì)照組顯著增多(P=0.021 8)；WST法檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組SOD活性顯著下降(P=0.002 7)(圖2、表1)。

2.4原代MC中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western-blot檢測(cè)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組中凋亡蛋白cleaved-caspase-3以及聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)的表達(dá)升高(圖3、表1)。

2.5GO對(duì)MC凋亡的誘導(dǎo) 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增高(P=0.000 7)(圖3、表1)。Hoechst染色結(jié)果顯示GO處理后MC核發(fā)生皺縮、碎裂，PI染色結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率更高(P=0.021 8)(圖4)。

3 討論

氧化應(yīng)激反映細(xì)胞內(nèi)ROS生成和清除的不平衡狀態(tài)，是許多疾病中細(xì)胞損傷的病理生理基礎(chǔ)[11～13]。內(nèi)耳MC中的線粒體和過(guò)氧化物酶體系均可產(chǎn)生ROS，其中線粒體是主要產(chǎn)生部位[14,15]，同時(shí)，細(xì)胞通過(guò)小分子抗氧化物質(zhì)、抗氧化酶和具有抗氧化作用的代謝酶組成的抗氧化系統(tǒng)維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡狀態(tài)。病理情況下，ROS過(guò)量產(chǎn)生，超過(guò)細(xì)胞自身的抗氧化系統(tǒng)清除能力時(shí)，便會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞受損甚至凋亡，引起其功能損害[16，17]。SOD作為細(xì)胞內(nèi)氧自由基清除劑,對(duì)氧化應(yīng)激引起的內(nèi)耳毛細(xì)胞及聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，病理狀況下SOD的活性可被抑制。20世紀(jì)80年代以來(lái)，許多學(xué)者已經(jīng)先后報(bào)道了耳蝸MC在老年性聾、藥物性聾、噪聲性聾中的氧化損傷機(jī)制。耳蝸細(xì)胞的代謝非常旺盛，可產(chǎn)生大量ROS，生理情況下，ROS被耳蝸?zhàn)陨淼目寡趸赶到y(tǒng)清除；病理狀態(tài)下，ROS的清除速率下降，會(huì)對(duì)耳蝸尤其是MC產(chǎn)生功能性的損傷，導(dǎo)致耳蝸內(nèi)環(huán)境紊亂，誘發(fā)各種類(lèi)型的神經(jīng)性聾[18～21]。因此建立穩(wěn)定可靠的耳蝸MC氧化應(yīng)激損傷模型對(duì)于進(jìn)一步探究其分子機(jī)制的意義重大。

表1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組凋亡相關(guān)指標(biāo)ROS、SOD含量對(duì)比±s)

GO在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中主要用來(lái)模擬過(guò)氧化環(huán)境，GO與過(guò)氧化氫酶組成一個(gè)氧化還原酶系統(tǒng)，能夠氧化β-D-葡萄糖生成H2O2和D-葡萄糖酸內(nèi)酯。H2O2屬活性氧，生理狀態(tài)下它能夠促進(jìn)細(xì)胞的代謝和增殖；但是過(guò)多的H2O2會(huì)導(dǎo)致包膜脂質(zhì)體過(guò)氧化、線粒體損傷、DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22，23]。本研究中先采用不同濃度的GO處理MC 24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)隨著GO濃度升高，MC活性逐漸降低，凋亡率逐漸升高，由此測(cè)得GO對(duì)MC損傷的IC50值為32.9 mU/ml，與最近發(fā)表文獻(xiàn)結(jié)果[24,25]相近。采用IC50值濃度(32 mU/ml)的GO作為供氧劑處理MC24小時(shí)以后，ROS和SOD檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組MC中ROS生成增多、SOD活性下降，細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)失衡，說(shuō)明本研究成功建立了MC的過(guò)氧化應(yīng)激模型。

對(duì)過(guò)氧化損傷致神經(jīng)性聾機(jī)制的研究一定程度上依賴可靠的動(dòng)物模型。本研究在用GO誘導(dǎo)大鼠MC氧化應(yīng)激后，結(jié)合常用的一些凋亡相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)所建模型的可靠性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，可見(jiàn)，Western-blot檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組MC中cleaved-caspase-3表達(dá)量增高，與國(guó)內(nèi)的一些研究結(jié)果[26]相同。聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶-1(PARP1)表達(dá)升高與細(xì)胞內(nèi)凋亡的發(fā)生相關(guān)[27]，本研究中實(shí)驗(yàn)組PARP1表達(dá)較對(duì)照組明顯升高；本研究采用Annexin V-FITC和propidium iodide (PI)法對(duì)比兩組細(xì)胞的凋亡水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，說(shuō)明32 mU/ml的GO顯著地促進(jìn)了MC的凋亡，與最新研究結(jié)果相近[26]。此外，Hoechst/PI染色也是常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法，Hoechst染料進(jìn)入包膜通透性發(fā)生改變的凋亡細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合并染色，本研究結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核發(fā)生皺縮、碎裂，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生了凋亡。以上這些結(jié)果均說(shuō)明，IC50濃度的GO處理的MC確實(shí)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，驗(yàn)證了該模型的可靠性和穩(wěn)定性。

綜上所述，本研究采用GO作用于體外培養(yǎng)MC的方法成功建立了穩(wěn)定可靠的大鼠耳蝸MC的氧化應(yīng)激損傷模型，為今后進(jìn)一步深入研究MC過(guò)氧化損傷的分子機(jī)制及臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

4 參考文獻(xiàn)

1 Yuan H, Wang X, Hill K, et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress[J]. Antioxidants &Redox Signaling, 2015, 22:1308.

2 Henderson D, Bielefeld EC, Harris KC, et al. The role of oxidative stress in noise-induced hearing loss[J]. Ear and Hearing, 2006, 27:1.

3 Wu X, Steigelman KA, Bonten E, et al. Vacuolization and alterations of lysosomal membrane proteins in cochlear marginal cells contribute to hearing loss in neuraminidase 1 deficient mice[J]. Biochimicaet Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 2010, 1802:259.

4 羅蓉, 孔維佳, 程華茂. 線粒體毒素誘導(dǎo)突發(fā)性耳聾模型血管紋損傷機(jī)制的研究[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2009, 18:128.

5 張坤生, 田薈琳. 過(guò)氧化氫酶的功能及研究[J]. 食品科技, 2007, 32:8.

6 Rewerska A, Pawelczyk M, Rajkowska E, et al. Evaluating D-methionine dose to attenuate oxidative stress-mediated hearing loss following overexposure to noise[J]. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 2013, 270: 1513.

7 Panayiotidis M, Tsolas O, Galaris D. Glucose oxidase-produced H2O2induces Ca2+-dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes-Its mechanism and measurement in mammalian systems[J]. Free Radic Biol Med, 1999, 26:548.

8 Rost D, Welker A, Welker J, et al. Liver-homing of purified glucose oxidase: a novel in vivo model of physiological hepatic oxidative stress (H2O2)[J]. Journal of Hepatology, 2007, 46:482.

9 Cholia RP, Kumari S, Kumar S, et al. An in vitro study ascertaining the role of H2O2and glucose oxidase in modulation of antioxidant potential and cancer cell survival mechanisms in glioblastoma U-87 MG cells[J]. Metabolic Brain Disease, 2017, 32: 1705.

10 Zhao XY, Sun JL, Hu YJ, et al. The effect of overexpression of PGC-1 alpha on the mtDNA4834 common;deletion in a rat cochlear marginal cell senescence model[J]. Hear Res, 2013, 296:13.

11 Siomek A, Tujakowski J, Gackowski D, et al. Severe oxidatively damaged DNA after cisplatin treatment of cancer patients.[J]. International Journal of Cancer, 2006, 119:2228.

12 Kolaczkowska EKP. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation[J]. Nature Reviews Immunology, 2013, 13:159.

13 王時(shí)俊, 鄒云增, 孫愛(ài)軍,等. 氧化應(yīng)激在乙醛引起的心肌細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2008, 24:1464.

14 雷義, 金文達(dá), 陳鋒. 活性氧與線粒體損傷[J]. 中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志, 2006,5:23.

15 Fariss MW, Chan CB, Patel M, et al. Role of mitochondria in toxic oxidative stress[J]. Molecular Interventions, 2005, 5:94.

16 Thomas JP, Lautermann J, Liedert B, et al. High accumulation of platinum-DNA adducts in strial marginal cells of the cochlea is an early event in cisplatin but not carboplatin ototoxicity[J]. Molecular Pharmacology, 2006, 70:23.

17 Casares C, Ram rez-Camacho R, Trinidad A, et al. Reactive oxygen species in apoptosis induced by cisplatin: review of physiopathological mechanisms in animal models[J]. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology, 2012, 269:2455.

18 Ren H, Zhou X, Luan Z, et al. The relationship between carotid atherosclerosis, inflammatory cytokines, and oxidative stress in middle-aged and elderly hemodialysis patients[J]. International Jouranl of Nephrology,2013, 9:25, 2013.

19 Kaur M, Sandhir R. Comparative effects of acute and chronic carbofuran exposure on oxidative stress and drug-metabolizing enzymes in liver[J]. Drug &Chemical Toxicology, 2006, 29:415.

20 Tafazoli S, Spehar DD, O'Brien PJ. Oxidative stress mediated idiosyncratic drug toxicity[J]. Drug Metabolism Reviews, 2005, 37:311.

21 Henderson D, Bielefeld EC, Harris KC, et al. The role of oxidative stress in noise-induced hearing loss[J]. Ear and Hearing, 2006, 27:1.

22 錢(qián)中清, 曾耀英, 王通,等. VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生H2O2及其促增殖作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2007, 23:533.

23 周健洪, 黎暉, 宋述財(cái),等. 過(guò)氧化氫對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2005, 26:1199.

24 Zhang Y, Yang Y, Zhen X, et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells[J]. Molecular Neurobiology, 2016, 53:5971.

25 Huang Q, Shen HM. To die or to live: the dual role of poly(ADP-ribose) polymerase-1 in autophagy and necrosis under oxidative stress and DNA damage[J]. Autophagy, 2009, 5:273.

26 Jiang HY, Yang Y, Zhang YY, et al. The dual role of poly(ADP-ribose) polymerase-1 in modulating parthanatos and autophagy under oxidative stress in rat cochlear marginal cells of the striavascularis[J]. Redox Biology, 2018, 14:361.

27 Chiarugi A, Moskowitz M A. PARP-1: a perpetrator of apoptotic cell death[J]? Science, 2002, 297:200.