孫江萍，趙 莉，俞文英，謝 晶,2,3，潘迎捷,2,3，趙 勇,2,3,*

黑變是影響南美白對蝦貨架期的一個重要因素，黑變大幅降低了對蝦的食用價值和經(jīng)濟(jì)價值[1]。黑變主要是由蝦體中多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）參與的酶促反應(yīng)引起的[2]。PPO將蝦體內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)再進(jìn)行聚合產(chǎn)生深色的高分子質(zhì)量物質(zhì)，最后在蝦的表面形成黑色的斑點[3-4]。為了抑制黑色斑點的形成，延長蝦的貨架期，市場上存在很多抑制黑變產(chǎn)生的抑制劑，比如綠茶提取物[5]、抗壞血酸[6]、金針菇提取物[7]、葡萄籽提取物[8]。這些抑制劑主要作用原理就是通過抑制蝦中PPO的活力達(dá)到抑制黑變的效果，從而延長對蝦的貨架期。

酸性電解水（acidic electrolyzed water，AEW）是近年來發(fā)展起來的一種新型殺菌保鮮技術(shù)。AEW是由一定濃度的電解質(zhì)溶液在電解槽進(jìn)行電離得到的，具有操作簡單、價格低廉等優(yōu)點[9]。AEW最大的優(yōu)勢在于其對人體及環(huán)境安全無污染[10-11]。AEW的pH值低，氧化還原電位（oxidation reduction potential，ORP）高（＞1 000 mV），并具有較高的有效氯濃度（available chlorine concentration，ACC），根據(jù)AEW pH值的不同，可將AEW分為弱AEW（pH 5.0～6.5）和強(qiáng)AEW（pH 2.3～2.7）[12]。目前有關(guān)AEW的研究主要聚焦在殺菌效果和食品保鮮等方面。殺菌方面，AEW對副溶血性弧菌[13]、大腸桿菌[14]、單增李斯特菌[15]、腸桿菌[16]等都有很強(qiáng)的殺滅效果。保鮮方面，周然等[17]用微AEW對水蜜桃進(jìn)行護(hù)色保鮮效果的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AEW能夠有效保護(hù)水蜜桃在貯存過程中的色澤。Jia Guoliang等[18]的研究表明，AEW對山藥的黑變具有明顯抑制效果。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)，將南美白對蝦于4 ℃條件下貯藏之前用AEW處理5 min，可以有效推遲蝦頭黑變的時間，延長南美白對蝦的貨架期[19]。

國內(nèi)外有關(guān)AEW的研究主要聚焦在其殺菌效果以及保鮮效果等基礎(chǔ)感官實驗，鮮有對AEW殺菌保鮮機(jī)理進(jìn)行深入的探索。在保鮮方面，盡管AEW對不同食品的護(hù)色作用已有一定的研究，然而對于AEW能夠護(hù)色的機(jī)理至今鮮見報道。本研究著重關(guān)注黑變生成過程的關(guān)鍵性酶——PPO的活力變化，對南美白對蝦頭部PPO進(jìn)行分離純化，并體外研究AEW對PPO活力的影響，以期初步解釋AEW延緩蝦頭黑變的機(jī)理，為AEW在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對蝦購自上海集貿(mào)市場。挑選規(guī)格、大小一致（（13±1）g）的南美白對蝦用于實驗。

L-多巴（L-3,4-dihydroxyphenylalanine，L-DOPA）、固體硫酸銨 國藥化學(xué)試劑公司；Sephadex G-100葡聚糖凝膠、DEAE-52纖維素、考馬斯亮藍(lán)G-250、甲叉雙丙烯酰胺、上樣緩沖液 生工生物工程股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-200型強(qiáng)酸性電解水制備儀 日本AMANO公司；pH/ORP測定儀 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RC-3F型高濃度有效氯測定儀 北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；CR21GⅢ型高速臺式冷凍離心機(jī)日本日立公司；層析柱（330 mm×16 mm） 上海炎靈精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AEW的制備

將1.5 g/L NaCl溶液倒入強(qiáng)酸性電解水制備儀中電離15 min后，獲得2 L AEW和2 L堿性電解水，將AEW裝入棕色瓶。用pH/ORP測定儀測定AEW的pH值、ORP，ACC用有效氯測定儀測得。由于AEW中有效氯具有時效性，實驗中AEW均采取現(xiàn)制現(xiàn)用的方式。

經(jīng)檢測，本實驗所用AEW的ACC為（72±1）mg/L，pH值為2.35±0.01，ORP為（1 172.40±0.46）mV。

1.3.2 前處理

將新鮮的南美白對蝦隨機(jī)分為2 組，分裝到無菌袋中，AEW處理組按料液比1∶9（m/V）加入AEW浸泡處理5 min后將AEW倒凈，放入4 ℃恒溫箱貯存5 d，每隔1 d取對蝦進(jìn)行顏色觀察、拍照。以去離子水處理南美白對蝦作為對照組。

1.3.3 PPO的提取、分級純化

PPO粗酶液的提取根據(jù)文獻(xiàn)[20]的工藝進(jìn)行。取20 g的蝦頭，按1∶3（m/V）加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2，含1 g/L十二烷基聚乙二醇醚、1mol/L NaCl，下同），用剪刀將蝦頭充分剪碎。浸提30 min后在8 000 r/min、4 ℃條件下高速冷凍離心30 min，去除沉淀，得到的上清液為粗酶液。

硫酸銨分級沉淀。取5 mL上述粗酶液，在不同飽和度（30%、40%、50%、60%、70%）硫酸銨條件下進(jìn)行沉析，靜置30 min后以12 000 r/min、4 ℃高速冷凍離心30 min，分別測定上清液（粗酶液）與沉淀中的PPO活力。

DEAE-52柱純化。DEAE-52纖維素柱填料填裝，然后在上述粗酶液中加入硫酸銨，使得飽和度達(dá)到40%，靜置，離心，去上清液，用緩沖液將沉淀溶解后加到DEAE-52柱中進(jìn)行分離，以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）作為洗脫液，流速0.75 mL/min，每9 min收集一管，共收集50 管，并為收集次序為基礎(chǔ)進(jìn)行編號，依次為1～50號，檢測每管中PPO活力。收集活力最高的3 管酶液（D1），備用。

Sephadex G-100柱純化。后將經(jīng)DEAE-52柱純化收集到的酶液D1進(jìn)行Sephadex G-100柱分離，以50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）作為洗脫液，流速0.75 mL/min，每9 min收集一管，共收集50 管，并以收集次序為基礎(chǔ)進(jìn)行編號，依次為1*～50*號，檢測每管中PPO活力。收集活力最高的4 管酶液（G1），備用。

濃縮：將兩種柱純化后得到的酶液D1和G1分別加到超濾管中，4 000 r/min、4℃條件下冷凍離心15 min，收集上部濃縮液（D2、G2）備用。

1.3.4 PPO活力的測定

PPO活力的測定采取文獻(xiàn)[21]的方法。反應(yīng)溫度為37 ℃，3 mL反應(yīng)體系中含有2.4 mL磷酸鹽緩沖液、200 μL L-DOPA（50 mmol/L）、400 μL酶液，混勻后，用移液器取200 μL到96 孔板，分別測定反應(yīng)10 min與反應(yīng)0 min后475 nm波長處吸光度，并計算吸光度差值。PPO的活力單位定義為每分鐘消耗1 μmol底物所需的酶量。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將D1、D2、G1、G2分別與上樣緩沖液1∶1（V/V）混合，上樣量20 μL，5%濃縮膠，10%分離膠，60 V電泳0.5 h后調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳2 h?？捡R斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色2 h，用脫色液（V（冰醋酸）∶V（乙酸）∶V（去離子水）＝1∶3∶6）進(jìn)行脫色，照膠，得到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）圖譜。

1.3.6 AEW對PPO活力的影響

取7 支5 mL離心管，加入400 μL酶液G2，分別加入體積分?jǐn)?shù)0.00%、0.33%、1.67%、3.33%、5.00%、6.67%、13.30%、20.00%、26.67%、33.33%的AEW，混勻后反應(yīng)3 min，分別加入2 400、2 390、2 350、2 300、2 250、2 200、2 000、1 800、1 600、1 400 μL磷酸鹽緩沖液，最后加入200 μL L-DOPA，混勻。用移液槍吸取200 μL轉(zhuǎn)移到96 孔板，測定475 nm波長處，37 ℃條件反應(yīng)10 min與反應(yīng)0 min的吸光度差值。

1.3.7 AEW抑制類型判斷

在1.3.6節(jié)所述反應(yīng)體系中，保持酶量不變，通過改變抑制劑AEW添加量（0.00%、0.67%、1.30%）及底物L(fēng)-DOPA濃度（5、10、15、20、25 mmol/L），測定吸光度變化，并計算出PPO進(jìn)行氧化還原反應(yīng)的初始速率V0。米氏方程如式（1）所示。

混合抑制方程如式（2）所示。

式中：V為酶反應(yīng)速率/（U/（mL·min））；Vmax為最大反應(yīng)速率/（U/（mL·min））；[S]為反應(yīng)底物濃度/（mmol/L）；[I]為抑制劑體積分?jǐn)?shù)/%；Km為米氏常數(shù)；Ki為抑制常數(shù)；α為表觀系數(shù)。

以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/[V]為縱坐標(biāo)制作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，根據(jù)直線交點位置判斷AEW的抑制類型，從動力學(xué)方程可知，斜率因為Km與Vmax都是非0常數(shù)，因此以[I]為橫坐標(biāo)，斜率為縱坐標(biāo)作圖，橫軸截距的絕對值為Ki值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用分析軟件Origin 8.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEW對蝦頭黑變的抑制效果

圖1 南美白對蝦在4 ℃貯存過程中的黑變情況Fig. 1 Photographs of Litopenaeus vannamei with or without AEW treatment during storage

由圖1可知，南美白對蝦在4 ℃貯藏過程中會迅速變黑，第1天對照組南美白對蝦發(fā)生了輕微的黑變，AEW處理組南美白對蝦色澤變化不明顯，第3天和第5天對照組南美白對蝦黑變情況十分嚴(yán)重，而第3天AEW處理組南美白對蝦只發(fā)生了輕微的黑變，第5天南美白對蝦的黑變程度與對照組南美白對蝦在第3天的黑變程度相近。用灰度掃描軟件（Image J）對圖中蝦的灰度進(jìn)行掃描，結(jié)果分別為：對照組第1、3、5天灰度分別為73、92、81；AEW處理組第1、3、5天灰度分別為83、105、92。灰度值越小顏色越深，從數(shù)據(jù)看，第1天對照組和AEW處理組的灰度值分別小于后兩天的測量值，分析偏小的原因可能是新鮮的蝦頭部原有的青色在圖片處理的時候自動默認(rèn)為黑色，導(dǎo)致掃描時灰度值偏小。整體上看，對照組每天的灰度值都小于AEW處理組的灰度值，說明對照組的黑變情況比AEW處理組的嚴(yán)重。因此，AEW可以減緩南美白對蝦黑變速率，從而延長其貨架期。此實驗結(jié)果與Wang Meng[16]、Lin Ting[19]等研究結(jié)果一致。研究表明，PPO是引起蝦黑變的關(guān)鍵性酶[22]，南美白對蝦產(chǎn)生免疫反應(yīng)時體內(nèi)的PPO會誘導(dǎo)蝦體的酚類物質(zhì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)[23]，醌類物質(zhì)經(jīng)過聚合反應(yīng)產(chǎn)生深色物質(zhì)，最后在蝦表面產(chǎn)生黑色斑點，而AEW 3 種獨特的性質(zhì)（低pH值、高ORP值、高濃度有效氯）都可能會使蝦體中的PPO失活，從而延緩了南美白對蝦的黑變速率。為了探究AEW是否能夠抑制蝦體中PPO活力，本研究將蝦體中的PPO進(jìn)行提取純化，并進(jìn)行體外酶動力學(xué)的探索。

2.2 南美白對蝦頭部PPO的提取純化

2.2.1 硫酸銨分級沉淀

硫酸銨沉淀法是蛋白質(zhì)純化過程中廣泛使用的一種有效的分離方法，不同飽和度硫酸銨條件下沉淀出來的蛋白不同[24]。為了確定目的蛋白的鹽析范圍，本實驗以硫酸銨飽和度為30%～70%的范圍、梯度10%為條件，測定經(jīng)沉淀離心后上清液和沉淀中的PPO活力。數(shù)據(jù)顯示，所有上清液都沒有檢測到PPO的活力。圖2顯示了不同飽和度硫酸銨沉淀條件下離心后所得沉淀的PPO活力。當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到40%時，離心所得沉淀的PPO活力最高，因此后續(xù)純化都采取40%飽和度硫酸銨進(jìn)行沉淀。

圖2 不同飽和度硫酸銨沉淀條件下PPO的活力Fig. 2 Salting out of PPO at various saturation degrees with ammonium sulfate

2.2.2 柱層析結(jié)果

圖3 南美白對蝦PPO的層析普通洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of PPO from Litopenaeus vannamei

PPO兩次層析的結(jié)果見圖3，陰離子交換層析洗脫線有一個高峰，為第4號管。數(shù)據(jù)顯示，第4～12號管中PPO活力較高，其中第4～6號管中的PPO活力最高，收集這3管的酶液（D1），混合后倒入裝好的Sephadex G-100進(jìn)行洗脫分離，收集50 管后測定每管的PPO活力，結(jié)果如圖3所示，洗脫線有一個高峰，為7*號管，其中第5*～8*號管中的PPO活力都比較高，分別為8.33、8.33、8.40、8.33 U/（mL·min）。收集這4 管酶液（G1，純化PPO），備用。

2.2.3 SDS-PAGE檢驗純化效果

圖4 南美白對蝦PPO的SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE patterns of PPO

本實驗使用SDS-PAGE檢測PPO的純化效果。電泳圖如圖4所示。D1、D2泳道的條帶并不單一，兩條主要條帶（75 kDa附近）下面還有幾條不明顯的條帶。G1、G2泳道主條帶下面的雜帶都已經(jīng)被篩除。由此得出，兩次層析分離純化PPO達(dá)到了理想的效果。不同蝦體中PPO的分子質(zhì)量不同，對蝦的種類、大小、性別以及產(chǎn)地都是影響其PPO分子質(zhì)量[25]及活力的因素。由圖4可知，最后所得PPO的分子質(zhì)量在75 kDa左右。

2.3 純化PPO動力學(xué)研究

2.3.1 AEW處理對純化PPO活力的影響

圖5 AEW處理對純化PPO活力的抑制效果擬合圖Fig. 5 Inhibitory effect of AEW on PPO

圖5 是不同添加量的AEW對純化PPO活力的抑制效果擬合圖。結(jié)果顯示，隨著AEW添加量的增加，純化PPO活力相應(yīng)降低。純化PPO初始活力為39 U/（mL·min），當(dāng)AEW添加量為1.67%時，純化PPO活力為12 U/（mL·min），當(dāng)AEW的添加量達(dá)到5.00%時，純化PPO的活力達(dá)到最低，為3 U/（mL·min）。結(jié)果說明AEW對純化PPO活力有顯著的抑制效果，并且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。pH值、離子種類等因素都會影響PPO活力[26]。AEW的pH值低，ORP高，并具有高濃度有效氯成分[27]，這些特性都是抑制純化PPO活力的關(guān)鍵因素。隨著AEW添加量的增加，純化PPO活力下降的速率呈現(xiàn)先快后緩的現(xiàn)象，推測可能是由于在不同添加量下AEW抑制純化PPO活力的主導(dǎo)因素不同，在快速抑制階段AEW的3 種性質(zhì)同時起作用；在AEW添加量較低或者較高的情況下，可能抑制純化PPO活力的主導(dǎo)因素比較單一。通過上述結(jié)果可以判斷，AEW確實可以通過抑制南美白對蝦中PPO的活力延緩對蝦黑變速率。

2.3.2 AEW對PPO活力的抑制類型判定

通過作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，判定AEW對PPO活力的抑制作用類型，圖6是在反應(yīng)體系中分別加入不同抑制劑和不同濃度底物后，測定的PPO反應(yīng)初始速率。由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖可見隨著AEW的加入，曲線的縱軸截距和橫軸截距都不斷增大，并在第三象限交于一點，由此可判定AEW對于PPO的抑制類型屬于混合型抑制[28]。說明AEW中多種成分都可以與PPO及其復(fù)合物進(jìn)行相互作用[29]。這可能是由于AEW中的不同氯離子成分與PPO及其復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合，抑制了酶的活力。通過進(jìn)一步計算，可得出抑制常數(shù)Ki為0.64 mmol/L。Ki與抑制劑作用效果相關(guān)，值越小，說明抑制作用越強(qiáng)[30]，說明了AEW對PPO的抑制效果越好。

圖6 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plots for the inhibition of AEW on the oxidation of L-DOPA by PPO

3 結(jié) 論

AEW能夠明顯抑制南美白對蝦的黑變速率，延長南美白對蝦的貨架期。

本研究通過硫酸銨沉淀法、DEAE-52陰離子交換層析、Sephadex G-100葡聚糖凝膠層析提取純化南美白對蝦中PPO，取得了較為理想的效果

通過研究AEW對PPO進(jìn)行抑制動力學(xué)發(fā)現(xiàn)，AEW能夠有效抑制蝦中PPO的活力，并呈混合型抑制，且抑制常數(shù)Ki為0.64 mmol/L。

本研究從內(nèi)源酶的角度解釋了AEW延遲對蝦黑變的原因。AEW通過抑制黑變過程中的關(guān)鍵酶的活力而抑制了南美白對蝦黑變。目前市場出現(xiàn)的PPO抑制劑大部分是競爭性抑制劑，對于混合型抑制劑則很少報道，本研究發(fā)現(xiàn)，AEW是PPO的一種混合型抑制劑，是一種新型的抑制劑成分。由于AEW的成分比較復(fù)雜，具體抑制活性成分還需進(jìn)一步探究。

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